Die metabolische Neuprogrammierung proinflammatorischer Makrophagen durch zielgerichtete Robursäure lindert wirksam die Symptome der rheumatoiden Arthritis

Jul 21, 2023

Signal Transduction and Targeted Therapy Band 8, Artikelnummer: 280 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine häufige chronisch entzündliche Erkrankung, die meist die Gelenke betrifft. Es wurde festgestellt, dass Robursäure (RBA), ein Inhaltsstoff aus dem Anti-RA-Kraut Gentiana Macrophylla Pall., eine starke entzündungshemmende Wirkung aufweist. Seine medizinische Anwendung ist jedoch durch seine Hydrophobie, mangelnde Zielfähigkeit und unklare Funktionsmechanismen begrenzt. Hier haben wir ein pH-responsives Dual-Target-Arzneimittelabgabesystem per Anhalter-RBA (RBA-NPs) konstruiert, das sowohl auf CD44- als auch Folatrezeptoren abzielt, und seinen pharmakologischen Mechanismus untersucht. Im Ratten-RA-Modell transportierten die Nanoträger RBA effektiv zu entzündlichen Stellen und verbesserten die therapeutischen Ergebnisse im Vergleich zu freiem RBA erheblich. Außerdem reduzierten sie die entzündlichen Zytokinspiegel stark und förderten die Gewebereparatur. Die folgende Analyse ergab, dass M1-Makrophagen in den Gelenken durch RBA auf den M2-Phänotyp umprogrammiert wurden. Da das Gleichgewicht von pro- und antiinflammatorischen Makrophagen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Immunhomöostase und der Verhinderung übermäßiger Entzündungen bei RA spielt, ist diese Neuprogrammierung wahrscheinlich für die Anti-RA-Wirkung verantwortlich. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass RBA-NPs den phänotypischen Wechsel von M1 zu M2 steuern, indem sie den Glykolysegrad über die Blockierung des ERK/HIF-1α/GLUT1-Signalwegs herunterregulieren. Unsere Arbeit entwickelte daher nicht nur ein zielgerichtetes Abgabesystem, das die Anti-RA-Effizienz von RBA deutlich verbesserte, sondern identifizierte auch ein potenzielles molekulares Ziel zur umgekehrten Neuprogrammierung von Makrophagen durch die Regulierung des Energiestoffwechsels.

Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine häufige chronische Autoimmunerkrankung, die einen komplexen pathologischen Verlauf aufweist, der durch Synovialentzündung und Gelenkläsionen gekennzeichnet ist.1 Leider reagierten etwa 40 % der RA-Patienten trotz jüngster Fortschritte bei immunspezifischen Therapien nicht auf die Behandlung mit einem einzigen Wirkstoff während 5–20 % gegen alle gängigen Medikamente resistent sind.2,3,4,5,6,7,8 Daher besteht ein großer Bedarf an neuen molekularen Ziel- und Anti-RA-Wirkstoffen, die alternative Optionen bieten. Naturprodukte können Chancen für diese Herausforderungen bieten. Es wurde entdeckt, dass Robursäure (RBA) aus den Extrakten von Gentiana Macrophylla Pall., einem Kraut zur Behandlung von rheumatoider Arthritis in Südostasien, starke biologische Aktivitäten aufweist, wie z. B. Anti-Osteoarthritis, entzündungshemmende Wirkung und die Linderung von TNF-bedingten Erkrankungen.9, 10,11,12,13,14,15 Es wurde jedoch noch nicht im RA-Modell getestet und sein Funktionsmechanismus ist unklar. Hier fanden wir heraus, dass RBA die RA-Symptome lindern kann und die Auswirkungen offenbar mit der Veränderung lokaler Makrophagen-Subpopulationen verbunden sind.

Makrophagen sind äußerst vielfältige Phagozyten, die wichtige Immunfunktionen spielen.16 Grob gesagt können sich die naiven Makrophagen (M0) nach unterschiedlichen Stimulationen in die klassischen proinflammatorischen (M1) oder immunsuppressiven (M2) Makrophagen polarisieren.17,18,19 Kein Wunder ist ein abnormaler Anstieg des M1/M2-Verhältnisses während der Entwicklung von RA.20,21 Die Umprogrammierung von M1-Makrophagen zu M2 mithilfe einer gezielten IL-10-Gentherapie könnte Arthritis-assoziierte Gelenkentzündungen und -schäden verhindern.22 Somit kann die Manipulation des Subtyps gelenkassoziierter Makrophagen erfolgen hat ein erhebliches therapeutisches Potenzial und macht die Hypothese, dass RBA M1-Makrophagen umprogrammiert hat, plausibler. Wir untersuchten daher, wie RBA die Makrophagen-Subpopulationen wieder ins Gleichgewicht brachte. Die Polarisation und Funktion von Makrophagen hängt eng mit ihrem Stoffwechselmuster zusammen.23 Im Allgemeinen nutzen M1-Makrophagen den glykolytischen Weg, um ihren hohen Energiebedarf für eine proinflammatorische Reaktion zu decken;24 wohingegen M2-Makrophagen überwiegend auf Fettsäureoxidation (FAO) und oxidative Phosphorylierung angewiesen sind ( OXPHOS)-Signalwegen.25 Während der RA-Progression scheinen Makrophagen in entzündeten Gelenken in einen hypermetabolischen Glykolysezustand mit steigenden M1/M2-Verhältnissen zu wechseln.26 Die Verwendung des glykolytischen Inhibitors 2-DG oder das Ausschalten kritischer glykolytischer Enzyme könnte die proinflammatorische Reaktion von Makrophagen unterdrücken. 27 Es scheint also, dass Makrophagen durch eine Änderung ihres Stoffwechselmodus umprogrammiert werden könnten. Tatsächlich fanden wir heraus, dass RBA extrazellulär regulierte Proteinkinasen (ERK) stimulieren kann, die zur Familie der tumorassoziierten mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPKs) gehören und ein vorgeschalteter Aktivator des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1α (HIF-1α) sind.28 ,29,30 HIF-1α ist eine Schlüsselkomponente des auf Hypoxie reagierenden Hauptregulators HIF-1, der die Expression von Proteinen steigert, die an Glykolysewegen beteiligt sind, und bei Aktivierung den Energieproduktionsmodus verschiebt.31,32,33

Daher könnte die Effizienz von RBA durch Abgabesysteme verbessert werden, die auf M1-Makrophagen abzielen. Motiv-Targeting ist eine gängige Strategie beim Design von Nanoträgern zur verbesserten ortsspezifischen Wirkstoffakkumulation. CD44-Rezeptor und Folatrezeptor werden auf der Oberfläche entzündungsfördernder Makrophagen in RA-Synovialzellen überexprimiert.34,35 Hyaluronsäure (HA) und Folat, die die natürlichen Liganden für CD44- und Folatrezeptoren sind, könnten daher für die gezielte Ansteuerung verwendet werden.36, 37,38 Darüber hinaus weist die entzündete Gelenkhöhle normalerweise einen niedrigeren pH-Wert auf, und ein pH-empfindliches Abgabesystem kann die Abgabe effizienter verbessern.39 Daher haben wir ein pH-empfindliches und CD44/Folat-doppelt zielgerichtetes Mizellenabgabesystem auf Basis von Poly-β-amino entwickelt Ester (PAE) zur Abgabe von RBA an M1-Makrophagen im RA-Gelenk (RBA-NPs), was die therapeutische Wirksamkeit von RBA erheblich verbesserte.40

Zusammenfassend haben wir eine selbstorganisierte Mizelle auf Basis eines amphiphilen Copolymers für die RBA-Abgabe (RBA-NPs) konstruiert und deren therapeutische Wirkung und Mechanismus bei der RA-Therapie untersucht. Die Mizellen sind pH-empfindlich und könnten mit aktivem Dual-Rezeptor-Targeting auf M1-Makrophagen abzielen. Infolgedessen zeigten RBA-NPs bei RA-Modellratten hervorragende therapeutische Wirkungen sowie eine gute biologische Sicherheit. Mechanistische Studien ergaben, dass RBA HIF-1α-vermittelte Glykolysewege blockieren könnte, was zu einer Neuprogrammierung von M1-zu-M2-Makrophagen führt und dadurch Entzündungen lindert und Gelenkgewebe umgestaltet. Diese Arbeit entwickelte ein wirksames RA-Therapeutikum auf Basis von RBA, entdeckte erstmals den Funktionsmechanismus von RBA in der RA-Therapie und zeigte, dass der ERK/HIF-1α/GLUT1-Signalweg ein vielversprechendes RA-Behandlungsziel sein könnte.

Das PAE-HA-FA-Copolymer wurde hauptsächlich durch Michael-Additionspolymerisation und Amidatreaktion synthetisiert (ergänzende Abbildung 1). PAE-HA-FA erschien als weißer, durchscheinender, massiver Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 160–161 °C, einem Molekulargewicht von 12.000 und einer Ausbeute von 89 %. Die chemischen Strukturen des erhaltenen Produkts PAE-HA-FA-Pfropfcopolymer wurden durch FT-IR (ergänzende Abbildung 2), 1H-NMR-Spektroskopie und 13C-NMR-Spektroskopie (ergänzende Abbildung 3) bestätigt. Das hergestellte Copolymer könnte sich zur gezielten Abgabe von RBA selbst zu Nanomicellen zusammensetzen (Abb. 1a, b). RBA-beladene FA-HA-PAE-Nanopartikel (RBA-NPs) und leere FA-HA-PAE-Nanopartikel (NPs) wurden beide mithilfe der Ultraschallmethode hergestellt. Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Bilder zeigten, dass die leeren NPs und RBA-NPs ungefähr kugelförmig mit einheitlicher Größe waren (Abb. 1c, d). Die Partikelgrößen der leeren NPs und RBA-NPs betrugen etwa 174,2 nm und 249,4 nm, gemessen mit DLS (Abb. 1e, f); und die Zetapotentiale leerer NPs und RBA-NPs betrugen –19, 9 mV bzw. –17, 6 mV (Abb. 1g, h). Darüber hinaus deuten die getestete kritische Mizellenkonzentration (CMC) und die Serumstabilität darauf hin, dass die Mizellen unter physiologischen Bedingungen im Allgemeinen stabil sind (ergänzende Abbildung 4a, b). In-vitro-Analysemethoden für FA-HA-PAE und RBA wurden in den unterstützenden Methoden, Ergänzungstabelle 1–4, Ergänzungsabbildung 5, 6 festgelegt. Die Reinheit von FA-HA-PAE betrug 97,29 % und kann für nachfolgende Experimente verwendet werden. Die Verkapselungseffizienz (EE) und die Wirkstoffbeladung (DL) von RBA-NPs betrugen 84,2 ± 1,3 % bzw. 9,6 ± 0,8 %.

Vorbereitung und Charakterisierung von leeren NPs und RBA-NPs. a Schematische Darstellung der Herstellung und des therapeutischen Mechanismus von RBA-NPs gegen RA. b Die chemische Struktur und das Molekulargewicht von RBA. c, d TEM-Bilder zeigten, dass die leeren NPs und RBA-NPs ungefähr kugelförmig mit einheitlicher Größe waren. e, f Die Partikelgrößen der leeren NPs und RBA-NPs betrugen etwa 174,2 nm und 249,4 nm, gemessen mit DLS. g, h Die Zetapotentiale leerer NPs und RBA-NPs betrugen −19,9 mV bzw. −17,6 mV. i Die In-vitro-Freisetzung von RBA aus RBA-NPs unter verschiedenen Bedingungen (pH = 5,0, 6,8 oder 7,4) in 72 Stunden. j Stabilität von RBA-NPs unter verschiedenen Bedingungen (pH = 5,0, 6,8 oder 7,4) in 24 Stunden

Da der PAE-Kern so konzipiert ist, dass er sich bei niedrigem pH-Wert abbaut, haben wir die kumulativen Freisetzungsraten von RBA aus Polymermizellen und die Partikelgröße leerer Mizellen bei verschiedenen pH-Bedingungen in vitro untersucht. PBS-Puffer bei pH 7,4, 6,8 und 5,0 wurde verwendet, um den normalen physiologischen Zustand, die Mikroumgebung der RA-Gelenke bzw. die Zyto-Lysosomen-Situation zu imitieren.41 Wie in Abb. 1i gezeigt, waren die RBA-NPs bei pH 7,4 relativ stabil und Die Freisetzungsraten von RBA waren langsam (ca. 14 % RBA wurden nach 24 Stunden freigesetzt und ca. 17 % nach 72 Stunden), ohne dass eine stoßartige Freisetzung erkennbar war. Im Vergleich dazu wurden bei pH 6,8 etwa 50 % RBA nach 24 Stunden und etwa 59 % nach 72 Stunden freigesetzt, und das Austreten von RBA wurde bei pH 5,0 weiter beschleunigt und erreichte etwa 71 % nach 24 Stunden und etwa 82 % nach 72 Stunden . Konsistent waren die Nanomizellen nach 24-stündiger Inkubation bei pH 7,4 stabil und die Mizellengröße nahm bei pH 6,8 und 5,0 signifikant zu (Abb. 1j). Somit konnten die RBA-beladenen Nanomicellen erfolgreich mit der angegebenen pH-Empfindlichkeit erzeugt werden.

Anschließend wurde die Targeting-Fähigkeit der hergestellten Nanoträger untersucht. Hier wurde 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanin (DiD) als Marker anstelle von RBA (DiD-NPs) verwendet, um die Aufnahme von Nanomicellen in Zellen und die Fluoreszenz zu markieren Lokalisierung bei Tieren.42 Zunächst wurde die zelluläre Aufnahme von freiem DiD und DiD-NPs durch CLSM und Durchflusszytometrie in RAW264.7- und LPS + IFN-γ-aktivierten RAW264.7-Zellen in vitro bewertet. CLSM-Ergebnisse zeigten, dass DiD-NPs im Vergleich zu freiem DiD eine deutlich verbesserte Zellaufnahme aufwiesen (Abb. 2a, b). Die Durchflusszytometrieanalyse zeigte, dass die Fluoreszenzintensität von DiD-NPs in LPS + IFN-γ-aktivierten RAW264.7-Zellen etwa 4,98-mal höher war als die von freiem DiD und 1,33-mal in RAW264.7 (Abb. 2c und ergänzende Abb. 7). ). Anschließend wurde die CD44- und Folatrezeptor-Targeting-Abhängigkeit der hergestellten NPs überprüft. Die Expression von CD44- und Folatrezeptoren nahm auf der Oberfläche von LPS + IFN-γ-aktivierten RAW264.7-Zellen signifikant zu (Abb. 2d). Wenn LPS + IFN-γ-aktivierte RAW264.7-Zellen mit freiem HA oder FA vorbehandelt wurden, um um die überexprimierten CD44- oder Folatrezeptoren zu konkurrieren, wurde die Aufnahme von DiD-NPs auf 51,8 % bzw. 65,1 % der unbehandelten Zellen reduziert; und wenn sowohl HA als auch FA hinzugefügt wurden, sank der Signalpegel auf 24,5 % (Abb. 2e). Konfokale Mikroaufnahmen zeigen, dass DiD-NPs mit dem CD44-Rezeptor und dem Folatrezeptor kolokalisierten, was darauf hindeutet, dass DiD-NPs auf duale Rezeptoren auf der Oberfläche proinflammatorischer Makrophagen abzielen könnten (Abb. 2f).

RBA-NPs zeigen in vitro eine Targeting-Fähigkeit. a, b Konfokalmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass DiD-NPs (rot) im Vergleich zu freiem DiD in LPS + IFN-γ-aktivierten RAW264.7-Zellen eine deutlich verbesserte Zellaufnahme aufwiesen. Maßstabsbalken = 10 μm. c Die Durchflusszytometrieanalyse zeigte, dass die Fluoreszenzintensität von DiD-NPs in LPS + IFN-γ-aktivierten RAW264.7-Zellen höher war als die von freiem DiD in RAW264.7. d Die Expression von CD44- und Folatrezeptoren nahm auf der Oberfläche von LPS + IFN-γ-aktivierten RAW264.7-Zellen signifikant zu (d). Maßstabsbalken = 10 μm. e LPS + IFN-γ-aktivierte Makrophagen wurden mit HA oder FA oder sowohl HA als auch FA vorbehandelt, um um die überexprimierten CD44- oder Folatrezeptoren zu konkurrieren, und die zelluläre Aufnahme von DiD-NPs wurde verringert. f Konfokale Mikroaufnahmen zeigten die Co-Lokalisierung von DiD-NPs (orange) mit dem CD44-Rezeptor (rot) und dem Folatrezeptor (grün). Maßstabsbalken = 20 μm. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD angezeigt. *P < 0,05. Die Dosis von LPS und IFN-γ betrug 100 ng/ml und 20 ng/ml

Anschließend wurde die Bioverteilung von NPs im Adjuvans-induzierten Arthritis-Rattenmodell (AIA) untersucht, das durch subkutane Injektion von CFA in die Schwanzbasis der Ratte etabliert wurde. Den modellierten Ratten wurde dann über die Schwanzvene intravenös freies DiD oder DiD-NPs injiziert. Die arthritischen Gelenke wurden geschnitten und mit Immunfluoreszenzmethoden gefärbt. Auch hier ist zu erkennen, dass der CD44-Rezeptor und der Folatrezeptor auf entzündlichen Makrophagen (gekennzeichnet durch CD68) in entzündeten Gelenken überexprimiert wurden (Abb. 3a). In Übereinstimmung mit In-vitro-Daten ist die DiD-Fluoreszenz im Synovialgelenk der mit DiD-NPs behandelten Gruppe höher als die der freien DiD-Gruppe (Abb. 3b, c). Darüber hinaus überlappt das DiD-Signal der DiD-NPs-Gruppe hauptsächlich mit dem CD44-Rezeptor und dem Folatrezeptor, wohingegen die freie DiD-Gruppe ein geringes Maß an Kolokalisierung des CD44-Rezeptors und des Folatrezeptors zeigte. Folglich wurden die Fluoreszenzintensitäten von DiD in Gelenken 0, 5, 2, 6, 12, 24 und 48 Stunden nach der Verabreichung unter Verwendung eines In-vivo-Bildgebungssystems gemessen (Abb. 3d und ergänzende Abb. 8a). Das Fluoreszenzsignal war in den entzündeten Gelenken von AIA-Ratten, die mit freiem DiD behandelt wurden, vernachlässigbar, während in den NP-Gruppen bereits nach 0,5 Stunden intensive Fluoreszenzsignale in arthritischen Gelenken beobachtet wurden. Die DiD-NPs-Gruppe zeigte zu jedem Zeitpunkt eine höhere Fluoreszenzintensität und die Fluoreszenz hielt bis zu 48 Stunden an. Die Verteilung der DiD-NPs in Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere und Gelenken von AIA-Ratten wurde auch 6, 12 und 24 Stunden nach der Verabreichung bewertet (Abb. 3e und ergänzende Abb. 8b). Es ist klar, dass die Fluoreszenzintensitäten in entzündeten Gelenken stärker waren als in Herz, Lunge und Niere. Der hohe Fluoreszenzspiegel in der Milz kann damit zusammenhängen, dass die Milz ein wichtiges Immunorgan ist. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die hergestellten Dual-Targeting-NPs beladene Ladungen effizient und selektiv an proinflammatorische Makrophagen abgeben und eine bemerkenswert verbesserte Akkumulation in entzündeten Gelenken von AIA-Ratten erreichen können.

RBA-NPs zeigen in vivo eine Targeting-Fähigkeit. a Konfokale Mikroaufnahmen zeigten die Expressionsniveaus des CD44-Rezeptors (grün) und des Folatrezeptors (grün) auf Makrophagen in den entzündeten Gelenken von AIA-Ratten. Makrophagen wurden durch CD68-Antikörper (rot) markiert. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 50 μm. b, c Konfokalmikroskopische Aufnahmen zeigten die Co-Lokalisierung von freiem DiD und DiD-NPs mit CD44-Rezeptor und Folatrezeptor in den entzündeten Gelenken von AIA-Ratten. Freie DiD- und DiD-NPs waren rot gefärbt. CD44-Rezeptor und Folatrezeptor waren grün gefärbt. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 50 μm. n = 5 unabhängige Tiere. d Die Abbildung der DiD-Fluoreszenz in Gelenken nach intravenöser Verabreichung von freiem DiD oder DiD-NPs zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung. n = 5 unabhängige Tiere. Die DiD-NPs-Gruppe zeigte zu jedem Zeitpunkt eine höhere Fluoreszenzintensität und die Fluoreszenz hielt bis zu 48 Stunden an. e Die Verteilung von DiD-NPs in Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere und Gelenken bei AIA-Ratten wurde 6, 12 und 24 Stunden nach der Verabreichung bewertet. n = 5 unabhängige Tiere. In entzündeten Gelenken waren die Fluoreszenzintensitäten stärker

Als nächstes wurde die therapeutische Wirksamkeit der RBA-NPs-Behandlung bei AIA-Ratten bewertet (Abb. 4a). In diesem Teil wurde ein Glukokortikoid-Medikament Dexamethason (Dex) als positive Medikamentenkontrollgruppe ausgewählt. Dex ist aufgrund seiner starken entzündungshemmenden und analgetischen Wirkung derzeit ein gängiges Medikament zur Linderung der Symptome von RA-Patienten. Das Verabreichungsschema der Dex-Gruppe war das gleiche wie das der RBA-NPs-Gruppe. Nach 14 Tagen Arthritis-Induktion zeigten die Knöchel und Pfoten von AIA-Ratten starke Schwellungen. Ratten wurden Kochsalzlösung oder RBA-NPs intravenös injiziert (5 mg/kg RBA). Wie in Abb. 4b, f und g dargestellt, zeigten RBA-NPs und Dex eine starke therapeutische Wirksamkeit, indem sie die Krankheitsentwicklung deutlich linderten und die Pfotenschwellung nach der Verabreichung reduzierten. Im Gegensatz dazu unterschieden sich die Pfotendicke und der Arthritis-Score von AIA-Ratten in der Gruppe mit leeren NPs kaum von der AIA-Gruppe, während freies RBA die Pfotenschwellung und den Arthritis-Score nur geringfügig reduzieren konnte. Um Gelenkentzündungen und Knorpelzerstörungsniveaus weiter zu bewerten, wurde eine histologische Analyse von Knöchelgelenkschnitten von Ratten durchgeführt. H&E-gefärbte Schnitte in der AIA- und leeren NP-Gruppe zeigten eine große Anzahl entzündlicher Zellinfiltrationen und schwere Synovialhyperplasie. Im Vergleich zur AIA-Gruppe hatte die freie RBA-Gruppe eine begrenzte Wirkung bei der Linderung dieser Symptome, während RBA-NPs und Dex die Synovialentzündung stark reduzierten (Abb. 4c). Die Safranin-O Fast-Green-Färbung zeigte, dass der Großteil des Knorpel- und Knochengewebes in einigen Gelenkabschnitten in der AIA- und leeren NP-Gruppe verschwand. Im scharfen Gegensatz dazu konnte in Gelenken von RBA-NPs und Dex-Gruppen intakter und rot gefärbter Knorpel gefunden werden, was zeigt, dass RBA-NPs die Gelenkknorpelläsion effektiv verringerten (Abb. 4d). Immunologisch waren die Milz- und Thymusindizes in der AIA-Gruppe im Vergleich zu normalen Ratten signifikant erhöht, während sie in der mit RBA-NPs und Dex behandelten Gruppe deutlich auf fast das Kontrollniveau reduziert waren (Abb. 4h, i). Die immunhistochemischen Tests ergaben, dass RBA-NPs die Sekretion von entzündlichen Zytokinen wie IL-1β (Abb. 4e), IL-6 (ergänzende Abb. 9) und TNF-α (ergänzende Abb. 9) in Knöchelgelenken wirksam herunterregulierten .

RBA-NPs hemmen Entzündungen und fördern die Reparatur von Knochenerosion bei AIA-Ratten. a Die schematische Darstellung der RBA-NPs-Behandlung. b Repräsentative Fotos der Hinterbeine am Endpunkt des Experiments aus verschiedenen Behandlungsgruppen. Maßstabsbalken = 10 mm. c Die histopathologische Beurteilung der Sprunggelenke erfolgte mittels H&E. Maßstabsbalken = 100 μm. d Nachweis einer Knorpelverletzung am Sprunggelenk von Ratten in jeder Gruppe durch Safranin O-Fast-Grünfärbung (n = 5 unabhängige Tiere). Maßstabsbalken = 100 μm. e Immunhistochemische Analysen der IL-1β-Expressionsniveaus in arthritischen Gelenken in verschiedenen Gruppen (n = 5 unabhängige Tiere). Maßstabsbalken = 80 μm. Die IL-6- und TNF-α-Expressionsniveaus in arthritischen Gelenken sind in der ergänzenden Abbildung 8 dargestellt. f, g Pfotendicke und Arthritis-Score von AIA-Ratten wurden jeden zweiten Tag während des Behandlungszeitraums aufgezeichnet. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 7 unabhängige Tiere). *P < 0,05 vs. NS-Gruppe. h, i Der Milz- und Thymusindex von AIA-Ratten wurde während des Behandlungszeitraums jeden zweiten Tag aufgezeichnet. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 7 unabhängige Tiere). #P < 0,05 vs. Normalgruppe; *P < 0,05 vs. NS-Gruppe. j Nachweis der TRAP-gefärbten Osteoklasten- und ALP-gefärbten Osteoblasten-Expressionsniveaus in arthritischen Gelenken in verschiedenen Gruppen (n = 5 unabhängige Tiere). Maßstabsbalken = 100 μm. In der Markhöhle befindliche Osteoklasten waren rot gefärbt. TRAP-positive mehrkernige Zellen, die mehr als drei Kerne enthielten, wurden als Osteoklasten bezeichnet. k RANKL/OPG-Verhältnis in arthritischen Gelenken von Ratten, die die angegebene Behandlung erhielten. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 5 unabhängige Tiere). l Repräsentative Mikro-CT-Bilder der anterolateralen und posterolateralen Sprunggelenke am Endpunkt des Experiments aus verschiedenen Behandlungsgruppen in der therapeutischen Wirksamkeitsstudie (n = 6). Maßstabsbalken = 2 mm. m–q Quantitative Mikro-CT-Analyse der Gelenkknorpelwerte, BMD, BS/BV, Tb.Sp und Tb.Th der Sprunggelenke am Endpunkt des Experiments. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 3 unabhängige Tiere)

Um zu überprüfen, ob RBA-NPs die Knochenfunktion wiederherstellen und die Gewebereparatur fördern können, haben wir die Auswirkungen von RBA-NPs auf die Expressionsniveaus verwandter Marker unter Verwendung immunhistochemischer, mit Tartrat-resistenter saurer Phosphatase (TRAP) gefärbter Osteoklasten und alkalischer Phosphatase (ALP) untersucht. gefärbter Osteoblast in arthritischen Gelenken (Abb. 4j). In der Markhöhle befindliche Osteoklasten wurden bei Verwendung des TRAP-Färbetests rot gefärbt, und TRAP-positive mehrkernige Zellen, die mehr als drei Kerne enthielten, wurden als Osteoklasten bezeichnet. Die Ergebnisse zeigten, dass Ratten in der AIA-Gruppe unter starker Osteoklastenbildung und Knochenerosion in den Knöchelgelenken litten, während RBA-NPs und Dex die Anzahl der Osteoklasten reduzierten und die Reparatur von Knochenschäden förderten, mit deutlich erhöhter ALP-Expression (Pfeile wurden verwendet, um die Stellen zu markieren, an denen Osteoblasten produziert wurden). . Weitere Experimente zeigten, dass RBA-NPs und Dex die Expressionsniveaus des Rezeptoraktivators des Kernfaktor-κB-Liganden (RANKL) und den hochregulierten Osteoprotegerin (OPG)-Spiegel in arthritischen Gelenken von Ratten senkten, was zu einem verringerten RANKL/OPG-Verhältnis führte (Abb. 4k und ergänzende Abb. 10).

Die Knochenerosion wurde dann mittels Mikro-CT-Analyse noch besser sichtbar verifiziert (Abb. 4l). Die oberen und unteren Bilder stellten die anterolateralen und posterolateralen Knöchelgelenke derselben Ratte dar. Mit Pfeilen wurden die Stellen markiert, an denen Knochengewebeschäden auftraten. Die AIA- und Blanko-NPs-Gruppen zeigten am 28. Tag nach der Behandlung eine raue Knochenoberfläche und schwere Knochenerosion im entzündeten Knöchel. Außerdem kam es in diesen beiden Gruppen im Vergleich zu normalen Ratten zu einer signifikanten Verringerung der Knochenmineraldichte (BMD), einem Anstieg der Gelenkknorpelwerte und des BS/BV. Während freie RBA die Knochenerosion nur mäßig linderte, führten die RBA-NPs und die Dex-Behandlung zu einer glatten Knochenoberfläche und einem hohen BMD, der dem der normalen Ratten nahekam (Abb. 4m–o). Es überrascht nicht, dass die Behandlung mit RBA-NPs und Dex die deutlichsten Auswirkungen auf die Verringerung der Trabekeltrennung (Tb.Sp) und die Erhöhung der Trabekelknochendicke (Tb.Th) zeigte (Abb. 4p, q). Alle diese Daten belegen, dass RBA-NPs das Fortschreiten von Knorpelschäden wirksam unterdrücken und die Reparatur von Knochenerosion bei AIA-Ratten fördern könnten.

Wie berichtet, könnte die Wiederherstellung des Gleichgewichts des unzureichenden M1/M2-Verhältnisses in RA-Gelenken Gelenkschäden mildern, da M1 offenbar in der Lage zu sein scheint, den pathologischen Prozess von RA voranzutreiben.43 Da RBA-NPs effizient von M1-Makrophagen internalisiert wurden und Entzündungen und Gewebeschäden deutlich hemmten, Es ist notwendig, seine Rolle bei der M1/M2-Polarisierung zu untersuchen.

Um diese Möglichkeit zu überprüfen, wurden Maus- und menschliche Makrophagenzelllinien RAW264.7 und THP-1-Zellen verwendet. Diese Zellen wurden mit LPS + IFN-γ oder IL-4 + IL-13 vorbehandelt, um die Polarisation des M1- oder M2-Phänotyps zu induzieren. Diese Zellen wurden dann durch Immunfluoreszenzfärbung von CD68 und F4/80 (die Pan-Makrophagen-Marker), CD86 (M1-Marker) und CD206 (M2-Marker) analysiert. Wie erwartet wurde ein deutlicher Anstieg von CD86 in mit LPS und IFN-γ vorbehandeltem RAW264.7 festgestellt. Nach der Behandlung mit RBA-NPs nahm die Fluoreszenzintensität von CD86 ab, während die Fluoreszenzintensität von CD206 zunahm, was darauf hindeutet, dass Makrophagen möglicherweise von M1- zu M2-Makrophagen repolarisiert wurden (Abb. 5a und ergänzende Abb. 11–13). Andererseits gibt es nach der Behandlung mit RBA-NPs keine merkliche Veränderung bei M2-Makrophagen. THP-1-Zellen lieferten ähnliche Ergebnisse (Abb. 5a und ergänzende Abb. 14). Diese Daten legen daher nahe, dass RBA-NPs die M1-zu-M2-Repolarisierung von Makrophagen sowohl bei Maus- als auch bei menschlichen Makrophagen wirksam förderten.

RBA-NPs programmieren proinflammatorische M1-Makrophagen in entzündungshemmende M2-Makrophagen in RAW264.7- und THP-1-Zellen um. a RAW264.7- und THP-1-Zellen wurden mit LPS + IFN-γ oder IL-4 + IL-13 vorbehandelt, um die Polarisation des M1- oder M2-Phänotyps zu induzieren. Immunfluoreszenzfärbung von CD68 (rot, Pan-Makrophagen-Marker), CD86 (M1-Marker, grün) oder CD206 (M2-Marker, grün) und Kernen (blau) auf Makrophagen des M1-Phänotyps ohne oder mit behandelten RBA-NPs. Maßstabsbalken = 20 μm. b Die Anteile von Makrophagen des M1-Phänotyps (CD86+) und M2-Phänotyp-Makrophagen (CD206+) ohne oder mit behandelten RBA-NPs wurden durch Durchflusszytometrie-Assay in RAW264.7- und THP-1-Zellen nachgewiesen. c Die Expression der Makrophagen-Herstellergene des M1-Phänotyps (iNOS, TNF-α, IL-1β) und des M2-Phänotyps (Arg-1, IL-10, TGF-β) wurde in RAW264.7- und THP-1-Zellen nachgewiesen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD, n = 5 ausgedrückt. #P < 0,05 vs. Normalgruppe; *P < 0,05 vs. M1-Gruppe

Darüber hinaus wurde diese Hypothese auch durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von RAW264.7- und THP-1-Zellen verifiziert (Abb. 5b, ergänzende Abb. 15, 16). Das Verhältnis von M1- und M2-Makrophagen verschob sich von 38,9 % bzw. 0,076 % auf 29,7 % bzw. 18,4 % in RAW264.7-Zellen nach der Behandlung mit RBA-NPs. In THP-1-Zellen änderte sich das Verhältnis von 53,5 % bzw. 0,32 % auf 25,8 % bzw. 30,9 %. Schließlich unterdrückten RBA-NPs deutlich die Expressionsniveaus von M1-Markern, einschließlich iNOS, TNF-α, IL-1β, und erhöhten die Niveaus von M2-Markern, einschließlich Arg-1, IL-10 und TGF-β (Abb. 5c), in beiden Zellen Linien. Zusammenfassend kommen wir zu dem Schluss, dass RBA-NPs den phänotypischen Übergang von Makrophagen von M1 zu M2 verursachten.

Anschließend untersuchten wir die Mechanismen der Neuprogrammierung von Makrophagen durch RBA-NPs mithilfe von Proteomikmethoden. Insgesamt wurden 4068 Proteine ​​in analysierten Makrophagen identifiziert (ergänzende Abbildung 17a). Im Vergleich zur Kontrolle veränderte die Behandlung mit RBA-NPs die Expressionsniveaus von 235 Proteinen signifikant, von denen 106 hochreguliert und 129 herunterreguliert waren (Abb. 6a, ergänzende Abb. 17b, ergänzende Materialien 1). Die Funktionen dieser Proteine, die sich erheblich auswirken, wurden mithilfe der Anreicherungsanalyse von Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) annotiert. Die Ergebnisse der GO-Analyse zeigten, dass diese Proteine ​​hauptsächlich an Stoffwechselprozessen, Prozessen des Immunsystems, angeborener und adaptiver Immunantwort, Entzündungsreaktion und katalytischer Aktivität beteiligt waren (Ergänzende Abbildung 18a – c, Ergänzende Abbildung 19a – d). Es ist nicht überraschend, dass Immun- und Entzündungsproteine ​​beteiligt waren, aber die hohe Anzahl identifizierter metabolischer Proteine ​​war unerwartet. Daher wurden verwandte Metabolomikwege dieser Proteine ​​​​durch KEGG-Anreicherung weiter analysiert (Abb. 6b). Es ist ersichtlich, dass Proteine, die von der RBA-NP-Behandlung betroffen sind, im Fettsäurestoffwechsel, in der Glykolyse und auf anderen Wegen angereichert werden. Daher schien die Behandlung mit RBA-NPs den Energiestoffwechsel und das Immunsystem auf der Ebene der Proteintranslation anzupassen. Wie bereits erwähnt, förderte die Immunmikroumgebung von RA die metabolische Umprogrammierung von FAO zur Glykolyse in Makrophagen.26 Interessanterweise stimmten die charakteristischen Stoffwechselmodi der M1- und M2-Makrophagen mit den Ergebnissen der Proteomik überein. Anschließend verwendeten wir die STRING-Datenbank, um Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI) zu konstruieren, um die funktionellen Beziehungen metabolischer relativer Proteine ​​zu analysieren (ergänzende Abbildung 20 und ergänzende Materialien 2). Die PPI-Netzwerke zeigen erneut, dass die am stärksten konzentrierten Proteine ​​in den Knoten diejenigen waren, die an drei wichtigen Stoffwechselprozessen beteiligt waren: Glykolyse, FAO und OXPHOS, wobei Glykolyse oft als ein wichtiges Stoffwechselmuster angesehen wird.

RBA-NPs steuern den phänotypischen Wechsel von M1 zu M2, indem sie den Glykolysegrad herunterregulieren, indem sie den ERK/HIF-1α/GLUT1-Signalweg blockieren. ein Vulkandiagramm aller in dieser Studie identifizierten Proteine. Rote und blaue Punkte zeigen signifikant hoch- bzw. herunterregulierte Proteine ​​an (Faltungsänderung von >1,5 oder <0,667 und p-Wert von <0,05). b Signifikant veränderte Signalwege der unterschiedlich exprimierten hochregulierten Gene basierend auf der KEGG-Analyse. Die von der RBA-NPs-Behandlung betroffenen Proteine ​​wurden im Fettsäurestoffwechsel, in der Glykolyse und auf anderen Wegen angereichert. c–e Das Histogramm von ECAR, relativem ATP und Laktatspiegel in verschiedenen Gruppen. Die Produktion von ECAR, relativem ATP und Laktat könnte die Fähigkeit zur Glykolyse widerspiegeln. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 5). *P < 0,05 vs. M0-Gruppe; #P < 0,05 vs. M1-Gruppe. Die f–h-IL-1β-, TNF-α- und IL-6-Spiegel wurden mit den Kits analysiert. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 5). *P < 0,05 vs. M0-Gruppe; #P < 0,05 vs. M1-Gruppe. i Immunfluoreszenzfärbung von LDHA (grün) und Kernen (blau) auf M1-Makrophagen in verschiedenen Gruppen. Maßstabsbalken = 20 μm. LDHA war der letzte Schritt im Prozess der katalytischen Glykolyse und ein wichtiger Indikator zur Messung des Glykolyseprozesses. j Immunfluoreszenzfärbung von ERK (rot), HIF-1α (grün), GLUT1 (rot) und Kernen (blau) auf M1-Makrophagen in verschiedenen Gruppen. Maßstabsbalken = 20 μm. RBA-NPs blockierten den ERK/HIF-1α/GLUT1-Signalweg signifikant. k Die Anteile von Makrophagen des M1-Phänotyps (CD86 + ) und Makrophagen des M2-Phänotyps (CD206 + ) auf M1-Makrophagen in verschiedenen Gruppen ohne oder mit Behandlung mit siERK wurden durch einen Durchflusszytometrietest nachgewiesen. l Die Expression der Makrophagen-Herstellergene des M1-Phänotyps (iNOS, TNF-α, IL-1β) und des M2-Phänotyps (Arg-1, IL-10, TGF-β) wurde nachgewiesen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD, n = 4 ausgedrückt. #P < 0,05 vs. Normalgruppe; *P < 0,05 vs. M1-Gruppe

Daher wurde die glykolytische Kapazität in M1-Makrophagen untersucht, um die Regulierung des intrazellulären Energiestoffwechsels durch RBA-NPs zu überprüfen. Die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) ist ein Indikator für die Glykolyseaktivität.44 Die Ergebnisse zeigen, dass die ECAR in M1-Makrophagen 2,5-fach höher war als in normalen Zellen (Abb. 6c). Nach einer Behandlung mit 20 oder 40 μM RBA-NPs normalisierte sich die ECAR von M1-Makrophagen nahezu wieder. Die ATP-Produktionseffizienz ist ein weiterer Indikator für die Glykolyse, da die ATP-Produktionseffizienz der Glykolyse weitaus niedriger ist als die der FAO.45 Wie in Abb. 6d gezeigt, konnte die niedrige ATP-Produktion von M1-Makrophagen durch die Behandlung mit RBA-NPs erhöht werden, wenn eine höhere Dosis gegeben war stärkere Wirkung. RBA-NPs verringerten außerdem dosisabhängig die Laktatproduktion, ein wichtiges Produkt während der Glykolyse (Abb. 6e). Gleichzeitig unterdrückten RBA-NPs den hohen Anteil an Laktatdehydrogenase A (LDHA) (Abb. 6i), der im letzten Schritt der katalytischen Glykolyse eine Schlüsselrolle im M1-Makrophagen spielt.46 Darüber hinaus hemmten RBA-NPs die Expressionen von IL-1β, IL-6 und TNF-α in M1-Makrophagen (Abb. 6f – h). Diese Daten deuten alle darauf hin, dass RBA-NPs den Glykolysegrad in M1-Makrophagen herunterregulierten und die höhere Dosis zu einer stärkeren Wirkung führt.

Im entzündlichen Zustand könnte HIF-1α die Synthese von Laktat steigern und Zielgene wie LDHA und GLUT1 hochregulieren, und die erhöhte Expression von HIF-1α ist ein Schlüsselmerkmal der Glykolyse von M1-Makrophagen.47 In frühen Untersuchungen fanden wir heraus dass die erhöhte Expression von HIF-1α durch RBA-NPs in M1-Makrophagen deutlich unterdrückt wurde und der HIF-1α-Inhibitor PX-478 eine funktionelle Redundanz mit RBA-NP zeigte (Ergänzende Abbildungen 21–23). Anschließend untersuchten wir weiter, wie RBA in Bezug auf HIF-1α-bezogene Signalwege wirkt.

Zuerst sammelten wir die mit RBA-NPs behandelten und unbehandelten Maus-M1-Makrophagenproben und verarbeiteten sie für die Proteomikanalyse. Die auf den Proteomikdaten basierende KEGG-Anreicherung zeigt, dass vier Arten von Proteinen im HIF-1-Signalweg (ko04066) signifikant verändert sind: Glucosetransporter 1 (GLUT1), Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK), FAD-bindende FR-Typ-Domäne enthaltend Protein (Cyb) und eukaryotischer Initiationsfaktor 4E2 (EIF4E2) (weitere Einzelheiten in der Ergänzungstabelle 5). GLUT1, das an Prozessen wie dem Glukosestoffwechsel und der Immunantwort beteiligt ist,48 erfuhr die stärkste Veränderung (p-Wert: 5,65231E-06). Genauer gesagt wirkt GLUT1 stromabwärts von HIF-1α und beschleunigt den Glukosetransport, um die hohen Glykolysegrade in proinflammatorischen Makrophagen zu unterstützen.49 Die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs) waren am zweithäufigsten betroffen (p-Wert: 2,04611E-05). ). Als wichtiges Mitglied der MAPK-Familie ist ERK in der Lage, die Expression von HIF-1α zu regulieren.50 Daher scheint es, dass der ERK/HIF-1α/GLUT1-Signalweg stark von RBA-NPs beeinflusst wird.

In folgenden Experimenten wurden ERK und GLUT1 weiter untersucht. Im Vergleich zu statischen Makrophagen war der Gehalt an ERK-, HIF-1α- und GLUT1-Protein in M1-Makrophagen tatsächlich erhöht (Abb. 6j und ergänzende Abb. 24). Die Behandlung mit 20 μM RBA-NPs verringerte den Spiegel dieser Proteine, und 40 μM RBA-NPs führten zu stärkeren Effekten, was darauf hindeutet, dass die Unterdrückung von RBA-NPs auf ERK, HIF-1α und GLUT1 konzentrationsabhängig war. Anschließend wurde ERK-siRNA verwendet, um ERK auszuschalten (Abb. 6j). Unter dieser Bedingung hatten RBA-NPs keinen Einfluss auf die Expression von HIF-1α und GLUT1, was mit dem aktuellen Signalmodell übereinstimmt, dass ERK HIF-1α und GLUT1 vorgeschaltet ist.

Weitere durchflusszytometrische Analysen zeigten auch, dass RBA-NPs im Grunde keinen Einfluss auf das M1/M2-Verhältnis nach dem Abbau von ERK hatten, da die Erschöpfung von ERK den Anteil der M2-Makrophagen selbst signifikant auf bis zu 68,8 % erhöhte (Abb. 6k und Ergänzung). Abb. 25). Im Gegensatz dazu reduzierten RBA-NPs ohne siERK-Behandlung erneut den Anteil CD68-positiver Makrophagen und erhöhten die Anzahl CD206-positiver Makrophagen. Darüber hinaus lieferte der Expressionstest von M1-Markern, einschließlich iNOS, TNF-α, IL-1β und M2-Markern, einschließlich Arg-1, IL-10, TGF-β, ebenfalls konsistente Ergebnisse (Abb. 6i).

Daher sprechen alle diese Beweise dafür, dass RBA-NPs möglicherweise die Makrophagenpolarisierung über die Blockierung des ERK/HIF-1α/GLUT1-Signalwegs umprogrammierten.

Die biologische Sicherheit von RBA-NPs wurde ebenfalls kurz sowohl in vitro als auch in vivo bewertet. Zunächst wurde die Zytotoxizität von NPs mithilfe von RAW264.7- und THP-1-Zellen in vitro bewertet. Die Zellen wurden 24 Stunden lang NPs in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Lebensfähigkeit der Zellen bei einer Konzentration von bis zu 40 μg/ml in beiden Zellen immer noch über 90 % lag (ergänzende Abbildungen 26, 27). Die Zytotoxizität von freiem RBA und RBA-NPs war dosisabhängig, wobei die Überlebensrate der Zellen von 80 % bei einer Dosis von 40 μM auf 50 % sank. bei 100 μM (Ergänzende Abbildungen 28, 29). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass RBA der Hauptfaktor war, der die Zellaktivität beeinflusste, während das Abgabevehikel die Zellaktivität innerhalb des untersuchten Konzentrationsbereichs nicht beeinflusste.

Anschließend wurden gesunde Ratten mit unterschiedlichen Dosierungen von RBA-NPs behandelt, und Blut, Urin und wichtige Organe dieser Ratten wurden nach einer vorgegebenen Zeitspanne entnommen und untersucht. Leberfunktionsindikatoren Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST) (Ergänzende Abb. 30a, b); Herzfunktionsindikatoren Kreatinkinase (CK) und Laktatdehydrogenase (LDH) (Ergänzende Abb. 30c, d); Nierenfunktionsindikatoren Kreatinin (CREA) und Harnsäure (UA) (Ergänzende Abb. 30e, f); Milzfunktionsindikatoren: weiße Blutkörperchen (WBC), rote Blutkörperchen (RBC) und Blutplättchen (PLT) (ergänzende Abbildung 30g–i); Lungengewebeödem-Indikator Lungen-W/D-Gewichtsverhältnis (ergänzende Abb. 30j); und das Körpergewicht der Ratte (ergänzende Abbildung 30k) wurden alle gemessen. Diese Indikatoren werden nach der RBA-NP-Behandlung nicht signifikant verschoben.

Schließlich wurden Herz-, Leber-, Milz-, Lungen- und Nierenproben geschnitten und H & E-gefärbt (ergänzende Abbildung 31). Die Bilder zeigten, dass RBA-NPs in diesen Organen keine klare Nekrose oder Entzündung hervorriefen. Somit scheinen RBA-NPs biokompatibel zu sein und verursachen keine akuten Schäden an wichtigen Organen.

Der M1-M2-Makrophagen-Phänotypwechsel ist das zentrale Thema dieser Studie. Wir fanden unerwarteterweise heraus, dass ein Wechsel des Stoffwechselwegs von M1-Makrophagen offenbar deren Polarisation umgekehrt regulierte (Abb. 5), da häufig angenommen wird, dass die Polarisation die Ursache für Stoffwechselveränderungen und nachfolgende funktionelle Veränderungen (z. B. Freisetzung von entzündlichen Zytokinen) ist.45,46 Soweit wir wissen, gibt es nur zwei neuere Berichte, die Hinweise auf eine solche metabolisch gesteuerte M1-zu-M2-Reprogrammierung liefern.47,48 Es gibt jedoch Literatur, die diesen Repolarisierungsmechanismus in gewisser Weise unterstützt. Erstens hält die robuste Glykolyse in Makrophagen die Transkription von Entzündungsfaktoren aufrecht und unterstützt die Polarisierung des M1-Phänotyps. Die Hemmung der Glykolyse könnte sich auf ihre typischen Funktionen auswirken, einschließlich Phagozytose, Sekretion entzündungsfördernder Zytokine und ROS-Produktion.49,50,51 Zweitens, M2-Makrophagen Die Polarisation im Tumor wird auch stark durch Glutaminolyse und andere damit verbundene Stoffwechselfaktoren beeinflusst.52,53,54

Im Allgemeinen scheinen die Signalwege der Glykolyse-Regulation stark mit dem Makrophagen-Phänotyp verknüpft zu sein. Der Hypoxie-bedingte HIF-1α-Signalweg scheint eine zentrale Rolle bei der erhöhten M1-Polarisierung bei RA zu spielen. Bei RA-betroffenen Gelenken ermöglicht die metabolische Verlagerung von FAO und OXPHOS zur Glykolyse in Makrophagen die Produktion von Energie unabhängig von der Sauerstoffversorgung.55 HIF-1α bindet an HIF-1β und bildet HIF-1 nach der Zellkerntranslokation unter hypoxischen Bedingungen.47 HIF- 1 bindet dann an die auf Hypoxie reagierenden Elemente und verstärkt die Transkription von IL-1β und Genen, die an Glykolysewegen beteiligt sind, wie z. B. GLUT1.33 Als Glukosetransporter reguliert GLUT1 die Glykolyseraten und verringert die Atmungskapazität.56 Zum Beispiel bei Gicht und mit Pseudogicht in Zusammenhang stehende Kristalle führten durch eine Erhöhung der GLUT1-Expression und der Glukoseaufnahme auf Makrophagen zu einer metabolischen Neuverdrahtung in Richtung des aeroben Glykolysewegs.57 Darüber hinaus sind alle 12 für die Glykolyse notwendigen Enzyme (wie LDHA, HK2 und PFK1) ebenfalls betroffen reguliert durch HIF-1α.58 Im Tiermodell schien die kombinierte Behandlung mit LPS und IFNγ auch HIF-1α zu stabilisieren und eine metabolische Umprogrammierung zur Glykolyse in M1-Makrophagen zu induzieren.59

Interessanterweise stellten wir fest, dass eine verringerte ERK-Aktivität möglicherweise zu einer Abnahme von HIF-1α in M1-Makrophagen nach der RBA-Behandlung geführt hat (Abb. 6). Es ist bekannt, dass ERK Teil der RAS/RAF/MEK/ERK-Kinase-Kaskade ist.50,60 Aktiviertes ERK erhöht nicht nur die HIF-1α-Translation, sondern kann auch seine Transkriptionsaktivierung verstärken.30 Da ERK-Knockdown einen sehr ähnlichen Effekt auf M1 zeigte Makrophagen als RBA-NPs-Behandlung, ERK könnte möglicherweise ein wertvolles Medikamentenziel für die RA-Behandlung sein, das den gleichen therapeutischen Mechanismus wie RBA hat. Obwohl es frühere Berichte gab, in denen ERK-Inhibitoren als mögliche Medikamente gegen RA identifiziert wurden und bekannt ist, dass ERK bei der metabolischen Reprogrammierung bei Krebs eine Rolle spielt, sind wir die ersten, die die Funktion von ERK im Zusammenhang mit der Makrophagenpolarisierung bei RA feststellen konnten.61,62 Dennoch ist die Stoffwechselveränderungen während/nach der Makrophagenpolarisierung sind äußerst komplex und vieles muss noch untersucht werden. Ein besseres Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Energiestoffwechsel und Makrophagenpolarisierung könnte dazu beitragen, mehr Therapeutika für RA zu entdecken, die auf anderen Mechanismen als aktuelle Medikamente beruhen.

Inwieweit die durch RA verursachten Gewebeschäden irreversibel sind, ist eine interessante Frage. In dieser Studie fällt eher auf, dass RBA-NPs den bestehenden Knochenschaden teilweise reparierten (Abb. 4). Bei RA-Patienten kommt es häufig zu sekundärer Osteoporose, da die erhöhte Anzahl an Osteoklasten das Osteoklasten-Osteoblasten-Gleichgewicht stark stört und die Knochenresorption fördert. Somit schien die M1-zu-M2-Repolarisierung von Gelenkmakrophagen die laufende Knochenresorption zu stoppen und den natürlichen Reparaturprozess beschädigter Knochen zu ermöglichen. Konsequenterweise könnten M2-Makrophagen entzündungshemmende Zytokine produzieren und den Gewebeumbau bei RA verbessern.19 Somit erweitert unsere Studie sowohl die medizinische Indikation von RBA als auch einen Weg zur Behandlung der Folgeerkrankung bei RA. Dennoch muss noch untersucht werden, wie sich die Neuausrichtung der Makrophagen auf die Anzahl der Osteoklasten und Osteoblasten auswirkt.

Zusammenfassend haben wir eine selbstorganisierte Nanomicelle mit pH-Empfindlichkeit und CD44/Folat-Rezeptor-Targeting-Fähigkeit konstruiert, um RBA abzugeben. Die entworfenen Mizellen mit hydrophoben Kernen kapselten RBA effizient ein. RBA-NPs zeigten eine deutlich erhöhte Akkumulation in Arthritisgelenken und eine starke Überlappung mit M1-Makrophagen. Infolgedessen boten RBA-NPs ein starkes therapeutisches Ergebnis gegen RA, indem sie M1- bis M2-Makrophagen umprogrammierten, um die Expression von Entzündungszytokinen zu hemmen und die Gewebereparatur zu fördern. Wir entdeckten auch, dass RBA-NPs diesen phänotypischen Wechsel von M1 zu M2 über die Blockierung des ERK/HIF-1α/GLUT1-Signalwegs induzierten. Daher haben wir in dieser Studie ein wirksames Anti-RA-Nanotherapeutikum auf Basis von RBA hergestellt, seinen Mechanismus aufgedeckt und ein Beispiel für die umgekehrte Modifizierung des Zelltyps durch Regulierung von Stoffwechselwegen geliefert.

Robursäure (RBA, CAS: 6812-81-3; Katalog B20723) wurde von Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd (Shanghai, China) bezogen. Natriumhyaluronsäure (HA, Molekulargewicht: 11,5 Kd) wurde von Freda Biopharm Co. Ltd (Shandong, China) bezogen. Folsäure (FA) wurde von Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen. NH2-PEG-FA und Fmoc-PEG-OH wurden von Ruixi Biotech Co. Ltd. gekauft.

Gesunde männliche Sprague-Dawley-Ratten (180–220 g) und männliche BALB/c-Mäuse (18–22 g, 6 Wochen alt) wurden von Chengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd. (Chengdu, China) gekauft. Die Mäuse wurden in einem Raum mit kontrollierter Temperatur (24 ± 2 °C) und Luftfeuchtigkeit (55 %) gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Die Tierversuche in dieser Studie wurden im Einklang mit Chinas nationalem Gesetz über Versuchstiere durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Ethics Committee der Sichuan University genehmigt. Die Maus-Zelllinie RAW264.7 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, USA) erworben. Als Zellkulturmedium wurde Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 1 % Penicillin und Streptomycin verwendet, das 10 % fötales Rinderserum (GIBCO, USA) enthielt. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

Die Synthese des FA-HA-PAE-Polymers umfasste drei Schritte.

Schritt 1: HA (500 mg), NH2-PEG-FA (2,5 Äquivalente), EDC (4,0 Äquivalente) und NHS (4,0 Äquivalente) wurden in wasserfreiem Formamid (15 ml) bei 40 °C gelöst und über Nacht bei 40 °C umgesetzt °C. Die Reaktionslösung wurde zur Ausfällung in eine große Menge Aceton gegossen und das FA-HA wurde durch Filtrieren erhalten.

Schritt 2: Fmoc-PEG-OH (2 g), Acryloylchlorid (2,0 Äquivalente) und Triethylamin (2,0 Äquivalente) wurden in 20 ml Chloroform gelöst und 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt von dreimaligem Waschen in Wasser . Die Produkte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach der Dekompressionskonzentrierung wurde eine große Menge Eisether in den Niederschlag gegossen und die Produkte wurden durch Zentrifugation gesammelt. Das Fmoc-PEG-Propylen wurde durch Vakuumtrocknung erhalten. Poly(β-aminoester) (PAE) wurde durch Michael-Additionspolymerisation synthetisiert. Fmoc-PEG-Propylen (1 g), 1,6-Bis(acryloyloxy)hexan (10,0 Äquivalente) und 1,3-Bis-(4-piperidin)propan (11,0 Äquivalente) wurden in 20 ml Chloroform gelöst und 48 h bei 55 °C gerührt. Nach dem Entspannen und Konzentrieren wurde die Reaktionslösung zur Ausfällung in eine große Menge Eisether gegossen, und die Produkte wurden filtriert und gesammelt. Die Fmoc-PEG-PAE wurden durch Vakuumtrocknung erhalten. Fmoc-PEG-PAE (1 g) und Piperidin (3 ml) wurden in 10 ml Chloroform gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt von dreimaligem Waschen in Wasser. Das Produkt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach der Dekompressionskonzentrierung wurde eine große Menge Eisether in den Niederschlag gegossen, und die Produkte wurden filtriert und gesammelt. Die NH2-PEG-PAE-Produkte wurden durch Vakuumtrocknung erhalten.

Schritt 3: FA-HA (500 mg), NH2-PEG-PAE (6,0 Äquivalente), EDC (7,5 Äquivalente) und DMAP (0,5 Äquivalente) wurden in wasserfreiem Formamid (15 ml) bei 40 °C gelöst und über Nacht umgesetzt bei 40 °C. Die Reaktionslösung wurde zur Ausfällung in eine große Menge Aceton gegossen. Das FA-HA-PAE wurde durch Filterung gewonnen.

Die Mizellen könnten durch die Selbstorganisationsfähigkeit von FA-HA-PAE-Polymeren hergestellt werden. 5 mg RBA und 15 mg FA-HA-PAE-Copolymer (RBA:FA-HA-PAE-Copolymer = 1:3, ww) wurden jeweils in 5 ml DMSO und 30 ml entionisiertem Wasser gelöst und dann gemischt. Die Mischung wurde mit einem Ultraschallgerät vom Sondentyp (Scientz, Ningbo, China) 10 Minuten lang bei 200 W emulgiert, um RBA-NPs zu erhalten. Um die entladenen Medikamente und überschüssiges DMSO-Lösungsmittel zu entfernen, wurden RBA-NPs 24 Stunden lang in einen Dialysebeutel (MWCO = 7000 Da) gegen entionisiertes Wasser geladen. Die leeren NPs wurden mit der gleichen Methode hergestellt, außer dass RBA hinzugefügt wurde. Die Partikelgrößen und Zetapotentiale leerer NPs und RBA-NPs wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) (Malvern ZetaSizer Nano ZS90, UK) charakterisiert und dazu wurde Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (H-600, Hitachi, Japan) verwendet Überwachen Sie ihre Morphologien. Die RBA-Konzentration wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer (Lambda 365, PerkinElmer, USA) mit Vollwellenlängenabtastung bestimmt, wobei die maximale Absorptionswellenlänge bei 210 nm lag. Im Fall von DiD-beladenen NPs wurde anstelle von RBA der lipophile Farbstoff DiD verwendet.

Die kumulative Freisetzung von RBA wurde mithilfe einer dynamischen Dialysetechnik unter verschiedenen pH-Bedingungen gemessen. RBA-NPs (1 mg) wurden in einen Dialysebeutel (MWCO = 7000 Da) gegeben und dann abwechselnd in 20 ml PBS-Puffer mit 0,5 % Tween 80 bei pH 7,4, 6,8 und 5,0 getaucht. In bestimmten Zeitintervallen (0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 36, 48 und 72 Stunden) wurde 1 ml des Freisetzungsmediums entnommen und durch ein äquivalentes Volumen frisches Medium ersetzt. Die Konzentrationen der freigesetzten RBA wurden dann mit einem UV-Vis-Spektrophotometer bestimmt.

RAW264.7-Zellen wurden in Platten mit 12 Vertiefungen in einer Dichte von 1 × 106 Zellen pro Vertiefung mit oder ohne LPS (100 ng/ml) und IFN-γ (20 ng/ml) ausgesät und 24 Stunden lang bei 37 °C kultiviert . Die Zellkulturmedien wurden durch 1 ml frisches Medium mit DiD-NPs (1 μg/ml DiD) ersetzt. Nach 2-stündiger Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Ein Durchflusszytometer (BD FACSCelesta, USA) wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität von DiD quantitativ zu analysieren. Die Zellen wurden fixiert und mit DAPI gefärbt und dann mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 800, Zeiss, Deutschland) fotografiert.

Der Schwanzbasis der Ratten wurde komplettes Freund-Adjuvans (80 μl), das 10 mg/ml hitzegetötete Mykobakterien enthielt (Chondrex, Nr. 7027, Washington DC, USA), subkutan injiziert. Die Entwicklung des Fortschreitens der Arthritis wurde täglich verfolgt und war 14 Tage nach der Injektion vollständig festgestellt.

Den Schwanzvenen von AIA-Ratten wurde freies DiD oder DiD-NPs verabreicht. Knöchelgelenke wurden 24 Stunden nach der letzten Verabreichung entnommen, um Schnitte vorzubereiten. Die vorbereiteten Schnitte von 10 μm dicken Schnitten wurden mit CD44-Antikörper (Affinity Biosciences, DF6392, 1:500), CD68-Antikörper (Affinity Biosciences, DF7518, 1:500) und FOLR2-Antikörper (Affinity Biosciences, DF9518, 1:300) gefärbt. . Die Kerne wurden mit DAPI gefärbt. Ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 800, Zeiss, Deutschland) wurde verwendet, um die Fluoreszenzverteilungen in Synovialgelenken aufzuzeichnen.

In die Schwanzvenen von AIA-Ratten wurde freies DiD oder DiD-NPs injiziert. Nach der Verabreichung wurde die Bioverteilung von DiD in den Sprunggelenken durch In-vivo-Bildgebungsmessung der Fluoreszenzintensität mit einem Caliper IVIS Lumina III In Vivo Imaging System (Perkin Elmer, USA) zu bestimmten Zeitpunkten (0,5, 2, 6, 12, 24 und 48 Stunden). Nach dem Fotografieren wurden die Ratten getötet und Herzen, Lebern, Milzen, Lungen, Nieren und Pfoten für die In-vivo-Bildgebung gesammelt. Bild J (National Institutes of Health, USA) wurde zur Quantifizierung der entsprechenden Fluoreszenzintensität verwendet. Als Kontrollen dienten mit NS behandelte AIA-Ratten.

Die Polarisation von M1-Makrophagen wurde durch 24-stündige Behandlung von RAW264.7 mit LPS (100 ng/ml) und IFN-γ (20 ng/ml) erreicht. Die M2-Makrophagenpolarisierung wurde durch Behandlung von RAW264.7 mit IL-4 (20 ng/ml) + IL-13 (20 ng/ml) für 24 Stunden erreicht. THP-1-Zellen wurden durch Zugabe von 100 ng/ml Phorbolmyristatacetat (PMA) für 48–72 Stunden zur Differenzierung in Makrophagen angeregt. Makrophagen vom Typ M1 wurden 48 Stunden lang mit LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (20 ng/ml) behandelt; Makrophagen vom Typ M2 wurden 48 Stunden lang mit IL-4 (20 ng/ml) + IL-13 (20 ng/ml) behandelt. THP-1-Zellen sind nach der Differenzierung adhärente Zellen. Die Verschiebung von M1-zu-M2-Makrophagen wurde 24 Stunden lang durch RBA-NPs (das Äquivalent von 20 μM RBA) induziert. Mithilfe von Immunfluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie wurden die Häufigkeiten von M1- und M2-Makrophagen ermittelt. Die Konzentrationen der Marker M1 (iNOS, TNF-α, IL-1β) und M2 (Arg-1, IL-10, TGF-β) wurden mithilfe eines ELISA-Assays bestimmt. Die Zellen wurden mit Blockierungspuffer (PBS-Lösung mit 5 % BSA) blockiert und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann mit Primärantikörpern gegen PE-Anti-Maus-CD68-Antikörper (Biolegend, 137013, 1:200), PE-Anti-Maus-F4, inkubiert /80-Antikörper (Biolegend, 123109, 1:100), PE-Anti-Human-CD68-Antikörper (Biolegend, 333807, 1:20), FITC-Anti-Maus-CD86-Antikörper (Biolegend, 105005, 1:100), APC-Anti-Maus-CD206 (MMR)-Antikörper (Biolegend, 141707, 1:100), FITC-Anti-Human-CD86-Antikörper (Biolegend, 374203, 1:20) und APC-Anti-Human-CD206 (MMR)-Antikörper (Biolegend, 321109, 1:50) bei 4 °C über Nacht. Nach der Gegenfärbung mit DAPI wurde das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 800, Zeiss, Deutschland) zur Abbildung der Schnitte verwendet.

Für die intrazelluläre Färbung wurden die Zellen durch Blockierungspuffer (PBS-Lösung mit 5 % BSA) blockiert und mit FITC-Anti-Maus-CD86-Antikörper (Biolegend, 105005, 1:100) und APC-Anti-Maus-CD206 (MMR)-Antikörper (Biolegend, 1:100) inkubiert. 141707, 1:100) bei 4 °C für 1 h an einem dunklen Ort. Die Zellen wurden dann in PBS gewaschen und durch Durchflusszytometrie (BD FACSCelesta, USA) nachgewiesen. Die Ergebnisse wurden mit der FlowJo-Software (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA) analysiert.

Die vierzig Ratten wurden zufällig in sechs Gruppen eingeteilt (n = 8): Normal, AIA-Ratten mit NS (NS), AIA-Ratten mit Dexamethason (0,5 mg/kg) (Dex), AIA-Ratten mit freiem RBA (5 mg/kg). ) (RBA), AIA-Ratten mit leeren NPs (Blank NPs) oder AIA-Ratten mit RBA-NPs (Dosis von 5 mg/kg für RBA) (RBA-NPs) mit intravenöser Verabreichung. Nach der Arthritisinduktion erfolgte die Behandlung an den Tagen 17, 20, 23 und 26. In der NS-Gruppe erhielten AIA-Ratten ein gleiches Volumen Kochsalzlösung. Während der Behandlung wurde alle zwei Tage die Pfotendicke der Knöchelgelenke beurteilt. Am 14. Tag wurde jedes Hinterbein auf einer Skala von 0 bis 4 bewertet: 0 bedeutet normal; 1 bedeutet leichtes Erythem und/oder Schwellung; 2 bedeutet mäßige Rötung und Schwellung; 3 bedeutet starke Schwellung; 4 bedeutet Ankylose und Unfähigkeit, Gewicht zu tragen. Die Gliedmaßenbewertungen jeder Maus wurden addiert, um eine maximale Punktzahl von 16 zu ergeben. Am 28. Tag wurden die Ratten durch Anästhesie (Pentobarbitalnatrium, 65 mg/kg, intraperitoneal) getötet. Thymus und Milz wurden sofort entnommen und gewogen. Die Thymus- und Milz-Indizes wurden jeweils berechnet, indem das Nassgewicht von Thymus und Milz durch das Körpergewicht (mg/10 g) dividiert wurde.

28 Tage nach der Arthritisinduktion wurden alle Ratten getötet. Die Sprunggelenke wurden entfernt und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Sprunggelenke wurden entkalkt und mit 15 %iger Tetranatriumethylendiamintetraessigsäure für 2 Monate fixiert. Die Schnitte wurden nach der Verarbeitung zur Paraffineinbettung in einer Dicke von 3 µm geschnitten und anschließend mit Hämatoxylin-Eosin (HE) und Safranin-O Fast-Green gefärbt. Zur Beobachtung der Färbung wurde ein Lichtmikroskop (Olympus BX53, Tokio, Japan) verwendet.

Zur Fixierung der Knöchelgelenke, die vor und zwei Tage nach der letzten Behandlung entnommen wurden, wurde 4 % Paraformaldehyd aufgetragen. Anschließend wurde eine 15 %ige Tetranatrium-Ethylendiamintetraessigsäure-Lösung zur Entkalkung der fixierten Sprunggelenke verwendet. Die Entkalkung erfolgte mit täglichem Wechsel einer 15 %igen (w/v) Tetranatrium-Ethylendiamintetraessigsäure-Lösung über einen Zeitraum von 2 Monaten. Die entkalkten Gelenke wurden anschließend in Paraffin eingebettet und anschließend zur Färbung geschnitten. Kommerzielle Streptavidin-Biotin-Komplex-Kits (SABC) (Boster, Wuhan, China) wurden verwendet, um polyklonale ALP-Antikörper (Invitrogen, PA5-106391, 1:200), Anti-RANKL (Abcam, ab239607, 1:100) und Anti- OPG (Abcam, ab203061, 1:200), polyklonaler IL-6-Antikörper (Proteintech, 23457-1-AP, 1:100), polyklonaler IL-1-Beta-Antikörper (Proteintech, 26048-1-AP, 1:100), Monoklonaler TNF-Alpha-Antikörper (Proteintech, 60291-1-Ig, 1:500) in den Gelenken. Das TRAP-Färbekit (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) wurde zum Färben dieser Abschnitte gemäß den Anweisungen verwendet.

Alle Ratten wurden am 28. Tag nach der Arthritisinduktion getötet. Nach der Fixierung in Paraformaldehyd in einer Konzentration von 4 % wurde eine Ex-vivo-Mikrocomputertomographie (Micro-CT, SCANCO MEDICAL VivaCT 80, Schweiz) verwendet, um die Knöchelgelenke bei 70 kV und 113 μA mit einer Auflösung von 15 μm zu scannen . Die 3D-Bilder der Gelenke und Trabekel des distalen Femurs wurden durch Neuaufbau des Datensatzes erstellt. Darüber hinaus wurden quantitative Analysen für bestimmte morphometrische Merkmale wie Knochenmineraldichte (BMD), Knochenoberfläche vs. Knochenvolumen (BS/BV), Trabekelseparation (Tb.Sp) und Trabekelknochendicke (Tb.Th) durchgeführt.

Gesunden Ratten (200 ± 20 g) wurden 5 mg/kg RBA, leere NPs oder RBA-NPs intravenös injiziert, um die In-vivo-Sicherheit von RBA-NPs zu untersuchen. Als NS-Gruppe wurden Ratten festgelegt, die mit einem äquivalenten Volumen Kochsalzlösung behandelt wurden. Die Ratten wurden zwei Tage nach der letzten Dosis geschlachtet und wichtige Organe wie Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere wurden zur histologischen Analyse entnommen, wie bereits berichtet. Die Werte von Alaninaminotransferase (ALT), Aspartataminotransferase (AST), Kreatinkinase (CK) und Laktatdehydrogenase (LDH), Kreatinin (CREA), Harnsäure (UA), weißen Blutkörperchen (WBC), roten Blutkörperchen (RBC). ) und Blutplättchen (PLT) im erhaltenen Serum der verabreichten Ratten wurden auf einem automatischen biochemischen Analysegerät Hitachi 7020 (Hitachi, Japan) untersucht. Lungengewebeödeme wurden anhand des Verhältnisses von Lungen-W/D bewertet. Das Lungengewebe wurde vom linken oberen Lungenlappen abgetrennt. Nach der Entfernung des Wassers wurden die Gewebe zunächst gewogen und erneut gewogen, gefolgt von einer 24-stündigen Dehydrierung bei 80 °C. Die Ergebnisse wurden als Nassgewicht geteilt durch Trockengewicht ermittelt.

Die RAW264.7-Zellen wurden dreimal in vorgekühltem PBS gewaschen, bevor sie 5 Minuten lang bei 4 °C und 1000 g zentrifugiert wurden. Nach dem Entfernen des Überstands wurden die Proben 5 Minuten lang in Lysepuffer (40 mM Tris-HCl, 4 % SDS, 2 M Thioharnstoff, 7 M Harnstoff, pH 8,5) mit 2 mM EDTA, 1 mM PMSF und 10 mM DTT inkubiert. Die Suspension wurde dann 5–15 Minuten lang auf Eis beschallt, bevor sie 20 Minuten lang bei 13.000 U/min und 4 °C zentrifugiert wurde. Eine vorgekühlte Acetonlösung mit vier Volumina wurde 2 Stunden lang bei –20 °C zum Überstand gegeben. Auf die Zentrifugation der Proteinpellets und die Resuspension in einer Harnstoff/TEAB-Lösung mit 8 M Harnstoff und 100 mM TEAB (pH 8,0) folgte Lufttrocknung. Proteinproben wurden 30 Minuten lang bei 56 °C mit 10 mM DTT reduziert und dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit 50 mM Iodacetamid (IAM) alkyliert. Der Probe wurden zur Zentrifugation 4 Volumina vorgekühltes Aceton bei –20 °C für 2 Stunden zugesetzt. Die luftgetrockneten Proteinpellets wurden in der oben genannten Harnstoff/TEAB-Lösung resuspendiert. Die Konzentration des Gesamtproteins wurde nach der Bradford-Methode bestimmt. Für den tryptischen Verdau wurde eine äquivalente Menge Protein aus jeder Probe (ca. 100 μg) eingesetzt. Das Trypsin wurde in einem Enzym-zu-Protein-Verhältnis von 1:50 (Gew./Gew.) eingeführt. Nach dem Verdau bei 37 °C für 12–16 Stunden wurden C18-Säulen zum Entsalzen der Peptide verwendet, die dann mit einem Vakuumkonzentrationsmessgerät getrocknet wurden. Trypsin wurde in einem Enzym-Protein-Verhältnis von 1:50 (Gew./Gew.) zugegeben und der Verdau wurde 12–16 Stunden lang bei 37 °C durchgeführt. Die Peptide wurden nach dem Verdau unter Verwendung von C18-Säulen entsalzt und die entsalzten Peptide wurden unter Verwendung eines Rotationsverdampfers getrocknet.

Wärmekarten wurden mit Perseus (1.6.2.2) erstellt. GeneCodis 3.0 wurde für die GO- und KEGG-Signalweganalyse verwendet. FDR (q-Wert) wurde verwendet, um die Proteine ​​von Interesse auszuwählen. In den quantitativen Ergebnissen wurde davon ausgegangen, dass das veränderte Protein differenziell exprimiert wurde, wenn die fache Änderung des Proteins > 1,5 oder < 0,667 betrug und der p-Wert < 0,05 war.

Die quantitativen Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Der zweiseitige Student-T-Test wurde zur statistischen Analyse eines Zweigruppenvergleichs verwendet. Für mehrere Vergleiche wurde eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) verwendet. Ein signifikanter Unterschied wurde bei einem P-Wert < 0,05 angenommen.

Die Autoren erklären, dass die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Papier und seinen ergänzenden Materialien verfügbar sind. Alle während dieser Studie generierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Alle Daten dieser Studie sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das iProX-Partner-Repository63,64 mit der Datensatzkennung PXD042274 beim ProteomeXchange-Konsortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) hinterlegt.

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Diese Arbeit wurde vom National Science Fund for Excellent Young Scholars (Nr.: 82022070) und dem Regional Innovation and Development Joint Fund (Nr.: U20A20411) unterstützt.

Schlüssellabor für Arzneimittel-Targeting und Arzneimittelabgabesysteme, Bildungsministerium, West China School of Pharmacy, College of Polymer Science and Engineering, Staatliches Schlüssellabor für Polymermaterialtechnik, West China School of Public Health und West China Fourth Hospital, Sichuan-Universität, Chengdu, 610041, VR China

Na Jia, Yunzhen Gao, Min Li, Yi Liang, Yunzhu Lin, Shiqi Huang, Qing Lin, Xun Sun, Qin He, Yuqin Yao, Ben Zhang, Zhirong Zhang und Ling Zhang

Abteilung für Pharmazie, West China Hospital, Sichuan-Universität, Chengdu, 610041, China

Yuwen Li

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Alle Autoren haben den Artikel gelesen und genehmigt. Konzeptualisierung: NJ, LZ und ZRZ Methodik: NJ, YZG, ML und YL Untersuchung: NJ, YWL, QH, YQY und BZ Visualisierung: NJ, ML und YZL Finanzierungseinwerbung: LZ und ZRZ Projektverwaltung: NJ, ZRZ , LZ, QL und XS Betreuung: LZ und ZRZ Schreiben – Originalentwurf: NJ, LZ, YZG und SQH Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung: NJ, LZ und ZRZ

Korrespondenz mit Ling Zhang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die metabolische Neuprogrammierung proinflammatorischer Makrophagen durch gezielt zugeführte Robursäure lindert rheumatoide Arthritis wirksam

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Jia, N., Gao, Y., Li, M. et al. Die metabolische Neuprogrammierung proinflammatorischer Makrophagen durch zielgerichtete Robursäure lindert wirksam die Symptome der rheumatoiden Arthritis. Sig Transduct Target Ther 8, 280 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01499-0

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Eingegangen: 22. Oktober 2022

Überarbeitet: 07. Mai 2023

Angenommen: 15. Mai 2023

Veröffentlicht: 28. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01499-0

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