Rezeptor für fortgeschrittenes Glykationsende

Aug 04, 2023

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 824 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Bei Säugetieren können sowohl professionelle Phagozyten als auch nichtprofessionelle Phagozyten (NPPs) eine Phagozytose durchführen. Allerdings werden nur begrenzte Ziele von NPPs phagozytiert, sodass der Mechanismus weiterhin unklar ist. Wir stellen fest, dass Sporen der Hefe Saccharomyces cerevisiae von NPPs effizient internalisiert werden. Analysen dieses Phänomens zeigen, dass RNA-Fragmente, die von zytosolischen RNA-Spezies stammen, an der Sporenwand befestigt sind und diese Fragmente als Liganden dienen, um die Sporeninternalisierung zu induzieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass ein Multiligand-Rezeptor, RAGE (Rezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte), die Phagozytose in Kernkraftwerken vermittelt. RAGE-vermittelte Phagozytose wird nicht ausschließlich durch Sporen induziert, sondern ist ein intrinsischer Mechanismus, durch den NPPs Makromoleküle, die RAGE-Liganden enthalten, internalisieren. Tatsächlich werden künstliche Partikel, die mit Polynukleotiden, HMGB1 oder Histon (jedoch nicht mit Rinderserumalbumin) markiert sind, in Kernkraftwerken internalisiert. Unsere Ergebnisse geben Einblick in die molekularen Grundlagen der Phagozytose durch NPPs, einem Prozess, bei dem eine Vielzahl von Makromolekülen zur Internalisierung gezielt werden.

Verschiedene eukaryotische Zellen können große Partikel (≥0,5 µm Durchmesser) verschlingen und sie über einen endozytischen Prozess namens Phagozytose verinnerlichen1. Bei Säugetieren hat sich eine Klasse von Zellen entwickelt, die Phagozytose durchführen; Diese Zellen, einschließlich Makrophagen, Neutrophile und dendritische Zellen, werden als professionelle Phagozyten bezeichnet1. Abgesehen von professionellen Phagozyten kommt die Phagozytose jedoch auch in vielen anderen Zellen vor, beispielsweise in Epithelzellen, Fibroblasten und Tumoren; Diese Zellen werden als nichtprofessionelle Phagozyten (NPPs)2,3,4,5 bezeichnet. Im Vergleich zu professionellen Phagozyten ist die Bandbreite der von NPPs internalisierten Makromoleküle begrenzt3. Dennoch haben Studien mit Mäusen mit Makrophagenmangel die funktionelle Redundanz zwischen NPPs und Makrophagen gezeigt, zumindest für die Entfernung apoptotischer Zellen6,7. Allerdings wurden nur sehr wenige Studien durchgeführt, um die physiologische Rolle der Phagozytose durch NPPs zu untersuchen, teilweise weil der molekulare Mechanismus kaum verstanden ist.

Zellen können große Partikel durch Phagozytose oder Makropinozytose verinnerlichen1. Makropinozytose ist ein Prozess, bei dem extrazelluläre Moleküle zufällig in Zellen internalisiert werden. Im Gegensatz dazu ist die Phagozytose ein rezeptor- und ligandeninduzierter endozytischer Prozess1. Daher werden bei diesem Prozess Partikel, die mit spezifischen Liganden dekolliert wurden, gezielt internalisiert. In professionellen Phagozyten finden sich verschiedene phagozytische Rezeptoren wie Fcγ-Rezeptoren, Integrine und Scavenger-Rezeptoren8. Im Allgemeinen werden phagozytische Rezeptoren durch die Bindung an ihre spezifischen Liganden aktiviert, was zu einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts und einer Verformung der Plasmamembran führt. Wenn sich die Plasmamembran um die Zielpartikel herum ausdehnt, binden phagozytische Rezeptoren nacheinander an ihren auf den Zielpartikeln präsentierten Liganden. Schließlich werden die Zielpartikel von der Plasmamembran umhüllt und in phagozytische Zellen internalisiert1. Internalisierte Partikel werden in einer membrangebundenen Struktur, dem sogenannten Phagosom, kompartimentiert, das durch Fusion mit Lysosomen zu Phagolysosomen heranreift9.

Ein Ziel unserer Studie ist die Verwendung von Sporen der Hefe Saccharomyces cerevisiae als Mikropartikel10. Hefesporen sind eine ruhende und stressresistente Zellform, die entsteht, wenn diploide Zellen unter Hungerbedingungen inkubiert werden11. Die Sporenbildung erfolgt im Inneren der Mutterzellen, wo vier durch Meiose erzeugte Kerne einzeln von der Sporenplasmamembran und der Sporenwand umschlossen sind. Durch diesen Prozess werden die Mutterzellen zu Asci, einschließlich vier Sporen. Im Gegensatz zu vegetativen Zellen haben Sporen Dityrosin- und Chitosanschichten auf der Außenseite ihrer Zellwand (Sporenwand)12. Chitosan kommt häufig in den Zellwänden von Pilzen vor, aber die Dityrosinschicht ist eine einzigartige Struktur, die in der Sporenwand von S. cerevisiae zu finden ist13,14. Der Hauptbestandteil der Dityrosinschicht ist ll-Bisformyldityrosin. Während die detaillierte Struktur dieser Schicht unklar bleibt, sind ll-Bisformyldityrosinmoleküle vermutlich vernetzt, um ein Makromolekül zu erzeugen, das kovalent an die Chitosanschicht gebunden ist15. Die Dityrosin- und Chitosanschichten machen Sporen resistent gegen Umweltstress11.

Im Verlauf unserer Studie führten wir ein Experiment zur Inkubation von Sporen mit kultivierten Säugetierzellen durch; In diesem Experiment haben wir festgestellt, dass Sporen in Kernkraftwerken phagozytiert werden. Eine weitere Analyse dieses Phänomens ergab, dass die Internalisierung von Sporen durch NPPs durch Rezeptoren für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) vermittelt wird. RAGE gehört zur Superfamilie der Immunglobulinrezeptoren und wurde ursprünglich als Rezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte identifiziert16,17. Es ist jedoch mittlerweile bekannt, dass RAGE mehrere Liganden erkennt, darunter Polynukleotide, Phosphatidylserin (PS) und High Mobility Group Box 1 (HMGB1)18,19,20. Die meisten RAGE-Liganden sind als schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) bekannt, und die Aktivierung des RAGE-Signalwegs löst bekanntermaßen Entzündungen aus21,22. RAGE kann seine Liganden über den endozytischen Weg verinnerlichen18,23. Darüber hinaus kann RAGE PS erkennen und ist an der Phagozytose apoptotischer Zellen (Efferozytose) in Makrophagen beteiligt19. Seine Rolle bei der Phagozytose in Kernkraftwerken ist jedoch unbekannt. Sporen werden in NPPs phagozytiert, weil ein RAGE-Ligand, RNA, an der Sporenwand befestigt ist. Neben Sporen werden in Kernkraftwerken auch mit RAGE-Liganden dekorierte Partikel phagozytiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Makromoleküle über RAGE-vermittelte phagozytische Prozesse in KKWs internalisiert werden können.

Im Ascus werden Hefesporen produziert (Ergänzende Abbildung 1a). Durch Aufbrechen der Ascalmembran und der Ascalwand können Sporen aus dem Asci freigesetzt werden (ergänzende Abbildung 1b). Bei der Inkubation von Sporen mit HEK293T-Zellen stellten wir fest, dass Sporen, jedoch keine vegetativen Hefezellen, eine Toxizität gegenüber HEK293T-Zellen zeigten (ergänzende Abbildung 1c). Im Gegensatz zu vegetativen Zellen weisen Sporen Dityrosin- und Chitosanschichten auf der Außenseite ihrer Zellwand (Sporenwand) auf12 (ergänzende Abbildung 1a). Da vegetative Zellen harmlos waren (ergänzende Abbildung 1c), spekulierten wir, dass die Toxizität der Sporen auf die einzigartige Struktur der Sporenwand zurückzuführen ist. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese zeigten dit1∆-Sporen, denen die Dityrosinschicht fehlt (ergänzende Abbildung 1a), keine Toxizität (ergänzende Abbildung 1c). Als mit Sporen inkubierte HEK293T-Zellen unter dem Mikroskop beobachtet wurden, stellten wir fest, dass Sporen in die Säugetierzellen internalisiert waren. Wir bestätigten, dass Sporen in Lysosomen eingebaut wurden, indem wir mit einer azitropen Sonde LysoTracker anfärbten (Abb. 1a, b). Sporen wurden von LysoTracker unter den in unserem Internalisierungstest verwendeten Bedingungen nicht angefärbt (ergänzende Abbildung 1d). Im Vergleich zu Wildtyp-Sporen waren die Internalisierungsgrade vegetativer Zellen und dit1∆-Sporen durch HEK293T-Zellen geringer (Abb. 1c, d). Wir fanden heraus, dass ein Teil der Sporen in HEK293T-Zellen nach 12-stündiger Inkubation anschwoll (ergänzende Abbildung 1e), was darauf hindeutet, dass Sporen in den kultivierten Zellen keimen könnten. Um zu beurteilen, ob die Lebensfähigkeit der Sporen mit ihrer Toxizität zusammenhängt, wurden durch Hitze abgetötete Sporen mit HEK293T-Zellen inkubiert. Der Grad der Sporeninternalisierung durch HEK293T-Zellen wurde durch die Wärmebehandlung nicht verändert (ergänzende Abbildung 1f); Durch Hitze abgetötete Sporen zeigten jedoch keine Toxizität (ergänzende Abbildung 1g). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Zytotoxizität von Sporen auf deren Internalisierung und Keimung zurückzuführen ist. Da S. cerevisiae kein pathogener Organismus ist, ist die physiologische Bedeutung der Toxizität der Sporen unklar. Dennoch interessiert uns das Phänomen, dass Sporen in kultivierten Zellen internalisiert werden; Daher wurde die Grundlage des Internalisierungsmechanismus weiter analysiert.

a Repräsentative Bilder von HEK293T-Zellen mit internalisierten Sporen, die GFP exprimieren, wurden mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) oder Fluoreszenzmikroskopie (Sporen und Lysosom) erhalten. HEK293T-Zellen wurden mit Sporen in einer Menge von 3,6 × 107 Sporen/4–6 × 105 HEK293T-Zellen/ml inkubiert. Lysosomen wurden mit LysoTracker Red gefärbt. Maßstabsbalken, 10 µm. b Anzahl der pro HEK293T-Zelle internalisierten Sporen (schwarze Kreise) und Prozentsätze der HEK293T-Zellen mit internalisierten Sporen (rote Dreiecke). HEK293T-Zellen wurden 1 Stunde lang mit verschiedenen Sporenmengen in DMEM inkubiert. c Internalisierung von Hefezellen in Kernkraftwerken. Sporen oder vegetative (veg) Zellen wurden mit HEK293T-Zellen bei 1,2 × 107 Hefezellen/4–6 × 105 HEK293T-Zellen/ml inkubiert; oder mit HEK293-Zellen, menschlichen Uroepithelzellen (HUC) oder HeLa-Zellen bei 1,2 × 107 Hefezellen/3,4–4,6 × 105 Säugetierzellen/ml. d Internalisierung von Wildtyp- (wt) oder dit1∆-Sporen in HEK293T-Zellen. e Internalisierung von Sporen in HEK293T-Zellen, die mit oder ohne (Kontroll-)Aktin-Polymerisationsinhibitor Latrunculin A (LAT-A), Milz-Tyrosinkinase-Inhibitor Piceatannol (PT) oder Phosphatidylinositol-3-Kinase-Inhibitor Wortmannin (WTM) behandelt wurden. f Auswirkung der Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (–) von 10 % fötalem Kälberserum (FCS) auf die Sporeninternalisierung in HEK293T-Zellen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (b–f) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests bestimmt. n = 3 (b–d, f), n = 4 (e). ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant (P ≥ 0,05).

Sporen können in verschiedenen Zelllinien internalisiert werden, darunter HEK293, HeLa und menschliche Uroepithelzellen (Abb. 1c). Unter den von uns getesteten Zelllinien internalisierten HEK293T-Zellen Sporen am effizientesten (Abb. 1c); Daher wurde diese Zelllinie für weitere Studien verwendet. Da Sporen einen Durchmesser von ca. 3 µm haben (ergänzende Abbildung 1b), werden sie wahrscheinlich durch Phagozytose oder Makropinozytose internalisiert. Da Sporen, wie unten beschrieben, auf die Internalisierung abzielen, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass Sporen durch Phagozytose internalisiert werden. Da die im Internalisierungstest verwendeten Zelllinien alle aus Epithelgewebe stammten, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Sporen in Kernkraftwerken Phagozytose induzieren. Ähnlich wie bei der Fcγ-Rezeptor-vermittelten Phagozytose in Makrophagen wurde die Internalisierung von Sporen in HEK293T-Zellen durch Inhibitoren der Aktinpolymerisation25, Milztyrosinkinase (SYK)26 und Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)27 gehemmt (Abb. 1e). Zusätzlich zum mikroskopiebasierten Phagozytose-Assay wurde die hemmende Wirkung der Inhibitoren bei der Sporeninternalisierung durch HEK293T-Zellen mit einem auf Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) basierenden Phagozytose-Assay verifiziert (ergänzende Abbildung 2). Die Expression von SYK in HEK293T-Zellen wurde durch Western Blot bestätigt (ergänzende Abbildung 3a). Darüber hinaus stellten wir fest, dass der Grad der Sporeninternalisierung durch HEK293T-Zellen durch SYK-Knockout verringert wurde (ergänzende Abbildung 3b). In dieser Studie wurden Phagozytosetests in den mit hitzeinaktiviertem Serum ergänzten Medien durchgeführt. Darüber hinaus internalisierten HEK293T-Zellen Sporen in Abwesenheit von Serum (Abb. 1f). Somit erfolgt die Internalisierung von Sporen in HEK293T-Zellen auch in Abwesenheit von Antikörpern und dem Komplementsystem.

Sporen werden in Kernkraftwerken effizient internalisiert, was darauf hindeutet, dass die Sporenwand mit einem Liganden dekoriert ist, um Phagozytose auszulösen. Da die Internalisierung von Sporen durch Waschen mit einer Lösung mit hohem Salzgehalt (0,6 M NaCl) gehemmt wurde (Abb. 2a), ist der Ligand höchstwahrscheinlich nichtkovalent mit der äußersten Schicht (Dityrosinschicht) der Sporenwand verbunden. Da Sporen im Zytosol der Mutterzelle gebildet werden (ergänzende Abbildung 1a), spekulierten wir, dass sich zytosolische Materialien an der Sporenwand festsetzen würden. Bemerkenswerterweise wurde der Grad der Sporeninternalisierung durch HEK293T-Zellen durch die RNase-Behandlung verringert, nicht jedoch durch die DNase-Behandlung (Abb. 2a). In Übereinstimmung mit dem Ergebnis wurde RNA im Eluat von Sporen nachgewiesen, die mit einer Lösung mit hohem Salzgehalt gewaschen wurden (Abb. 2b). Auch der Internalisierungsgrad der Sporen wurde durch die Proteasebehandlung verringert (Abb. 2a). Im Vergleich zu Wildtyp-Sporen wurden beim Waschen von dit1∆-Sporen mit einer Lösung mit hohem Salzgehalt geringere Mengen an RNA aus der Sporenwand freigesetzt (Abb. 2c), ein Ergebnis, das mit der Beobachtung korrelierte, dass die Sporen internalisiert wurden durch HEK293T-Zellen wurden durch die dit1∆-Mutation verringert (Abb. 1d). Der FACS-basierte Phagozytosetest zeigte auch, dass die Sporen enthaltenden HEK293T-Zellen verringert wurden, wenn die Sporen mit RNase, Protease oder einer Lösung mit hohem Salzgehalt behandelt wurden (ergänzende Abbildung 4).

a Internalisierung von mit den angegebenen Reagenzien behandelten Sporen in HEK293T-Zellen. b Nachweis von an der Sporenwand gebundener RNA. Aus salzreichen Sporeneluaten gereinigte Nukleinsäuren wurden mit den angegebenen Enzymen behandelt. Diese behandelten und unbehandelten (Kontroll-)Proben wurden einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und mit einem fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff angefärbt. Als Referenz diente ein doppelsträngiger DNA-Marker. c Linkes Feld: Nachweis von RNA, die an Wildtyp- (wt) oder dit1∆-Sporen gebunden ist. Rechtes Feld: Menge an RNA, die aus 2 × 108 Wildtyp- (wt) oder dit1∆-Sporen eluiert wurde. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (a, c) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests bestimmt. n = 3 (a, c). ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns nicht signifikant (P ≥ 0,05).

Die Internalisierung von Sporen kann durch eine einzigartige RNA induziert werden, die an der Sporenwand befestigt ist. So wurde sporenwandgebundene RNA durch RNA-Sequenzierung identifiziert. Der Großteil der aus der Sporenwand freigesetzten RNA-Fragmente hatte eine Länge von 25 bis 29 Nukleotiden (nt) (ergänzende Abbildung 5a). Das RNA-Sequenzierungsergebnis (hinterlegt in der Sequence Read Archive-Datenbank, Zugangsnummer PRJNA748575) zeigte, dass mehr als die Hälfte der RNA-Fragmente von tRNA-Sequenzen abgeleitet waren (ergänzende Abbildung 5b). Bemerkenswerterweise waren 87% der von tRNA abgeleiteten Fragmente Fragmente, die von tRNAAsp-Arten abgeleitet waren (ergänzende Abbildung 5c). Neben tRNA-Fragmenten wurden auch von rRNA, viraler RNA und mRNA abgeleitete Fragmente gefunden (ergänzende Abbildung 5b). Daher ist die Sporenwand mit einer Vielzahl zytosolischer RNA-Sequenzen verziert.

Da tRNA am häufigsten in sporenwandgebundener RNA vorkommt, haben wir analysiert, ob die Phagozytose durch HEK293T-Zellen ausschließlich durch tRNA induziert wird. Zu diesem Zweck untersuchten wir die Internalisierung von tRNA-gebundenen Latexkügelchen durch HEK293T-Zellen. Es wurde gezeigt, dass Latexkügelchen, die Oberflächenamingruppen enthalten, gereinigte tRNA adsorbieren (Abb. 3a). Der Grad der Internalisierung von Latexkügelchen durch HEK293T-Zellen wurde durch die Bindung von tRNA erhöht (Abb. 3b). Latexkügelchen wurden von LysoTracker im Internalisierungstest nicht angefärbt (ergänzende Abbildung 1d). Allerdings war der Grad der Internalisierung von Polynukleotid-gebundenen Latexkügelchen geringer als der von Sporen; Wie in Abb. 2a (Kontrolle) und 3b (tRNA) gezeigt, betrugen ihre Internalisierungsgrade 0,18 oder 1,18, wenn 1,2 × 107 Kügelchen (inkubiert mit tRNA bei 300 µg/2 × 108 Kügelchen/ml) oder Sporen mit HEK293T-Zellen inkubiert wurden pro HEK293T-Zellen. Wir untersuchten auch die Internalisierung von RNA-gebundenen Latexkügelchen aus der Sporenwand (Abb. 3b) durch HEK293T-Zellen. Latexkügelchen adsorbierten aus unbekanntem Grund mehr von der Sporenwand abgeleitete RNA als tRNA (Abb. 3a), obwohl keine Unterschiede zwischen den Internalisierungsgraden von von der Sporenwand abgeleiteten RNA-gebundenen Latexkügelchen und tRNA-gebundenen Latexkügelchen festgestellt wurden (Abb. 3b). .

a An Latexkügelchen gebundene RNA-Mengen. Von der Sporenwand abgeleitete RNA (Sporen-RNA) oder tRNA wurden mit Latexkügelchen in den angegebenen Konzentrationen inkubiert und die an die Kügelchen gebundenen RNA-Mengen wurden gemessen. b Internalisierung von RNA-gebundenen Latexkügelchen in HEK293T-Zellen. Obere Felder: Repräsentative Bilder von Zellen mit internalisierten tRNA-gebundenen Latexkügelchen. Maßstabsbalken, 10 µm. Unteres Feld: Die angegebenen RNA-gebundenen Latexkügelchen wurden mit HEK293T-Zellen in den angegebenen Konzentrationen inkubiert. Dargestellt ist die durchschnittliche Anzahl der pro HEK293T-Zelle internalisierten Perlen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests bestimmt. n = 3. *P < 0,05; **P < 0,01; ns nicht signifikant (P ≥ 0,05).

Wie Latexkügelchen, die Oberflächenamingruppen enthalten, weisen dit1∆-Sporen eine positiv geladene Chitosanschicht an der Sporenwandoberfläche auf (ergänzende Abbildung 1a). Dennoch könnten Wildtyp-Sporen mehr RNA enthalten als dit1∆-Sporen (Abb. 2c), was auf das Vorhandensein einer Maschinerie zur Aufnahme von RNA in der Dityrosinschicht schließen lässt. An dieser Maschinerie sind wahrscheinlich Proteine ​​beteiligt, da die Proteasebehandlung zu einem Verlust der an die Sporenwand gebundenen RNA führte (ergänzende Abbildung 6a). Die RNA-Bindungsmaschinerie verbleibt während des Waschens mit hohem Salzgehalt an der Sporenwand. Tatsächlich adsorbierten mit hohem Salzgehalt gewaschene Sporen von der Sporenwand stammende RNA (Abb. 4a). Die Internalisierung von mit hohem Salzgehalt gewaschenen Sporen durch HEK293T-Zellen wurde durch die Bindung von aus der Sporenwand stammender RNA verbessert (Abb. 4b). Der Grad der Internalisierung von Sporenwand-abgeleiteten RNA-gebundenen, mit hohem Salzgehalt gewaschenen Sporen war höher als der von Sporenwand-abgeleiteten RNA-gebundenen Latexkügelchen; wenn der Phagozytosetest mit 1,2 × 107 Sporenwand-abgeleiteten RNA-gebundenen Sporen (inkubiert mit der RNA bei 40 µg/2 × 108 Sporen/ml) oder Latexkügelchen (inkubiert mit der RNA bei 300 µg/2 × 108) durchgeführt wurde Kügelchen/ml) betrugen ihre Internalisierungsgrade 0,87 bzw. 0,22 pro HEK293T-Zellen (Abb. 3b, 4b). Da mit hohem Salzgehalt gewaschene Sporen mehr Polynukleotide adsorbierten als Latexkügelchen (ergänzende Abbildung 6b), hängt die Effizienz der Internalisierung durch HEK293T-Zellen möglicherweise von der Menge der an Partikel gebundenen Polynukleotide ab. Wie bereits erwähnt, wurden keine Unterschiede zwischen den Internalisierungsgraden von aus der Sporenwand stammenden RNA- und tRNA-gebundenen Latexkügelchen gefunden. Dieser Widerspruch ist möglicherweise auf die geringen Internalisierungsgrade polynukleotidgebundener Latexkügelchen zurückzuführen (Abb. 3b).

a Mengen an Polynukleotiden, die an mit hohem Salzgehalt gewaschene Sporen gebunden sind. Mit hohem Salzgehalt gewaschene Sporen wurden mit aus der Sporenwand stammender RNA (Sporen-RNA), tRNA oder DNA1 in den angegebenen Konzentrationen inkubiert. An die Sporen gebundene Polynukleotide wurden in einer Lösung mit hohem Salzgehalt eluiert und ihre Mengen gemessen. b Internalisierung von Polynukleotid-gebundenen, mit hohem Salzgehalt gewaschenen Sporen in HEK293T-Zellen. Mit hohem Salzgehalt gewaschene Sporen, die mit von der Sporenwand abgeleiteter RNA (Sporen-RNA), tRNA oder DNA1 in den angegebenen Konzentrationen inkubiert wurden, wurden mit HEK293T-Zellen inkubiert. Dargestellt ist die mittlere Anzahl der pro HEK293T-Zelle internalisierten Sporen. c Internalisierung von mit hohem Salzgehalt gewaschenen Sporen (2 × 108), inkubiert mit (+) oder ohne (–) 40 µg der angegebenen Polynukleotide in HEK293T-Zellen. Als Kontrolle wurden unbehandelte Sporen mit HEK293T-Zellen inkubiert (Salzwäsche −). d Sporeninternalisierung in HEK293T-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit (Kontrolle) der angegebenen Polynukleotide. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests bestimmt. Für a, b wurden Student-t-Tests zwischen Sporenwand-abgeleiteten RNA- und tRNA- oder DNA1-Daten durchgeführt. n = 3 (a, b, d), n = 4 (c). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ns nicht signifikant (P ≥ 0,05).

Abgesehen von der aus der Sporenwand stammenden RNA adsorbierten die Sporen auch gereinigte tRNA und ein einzelsträngiges 22-nt-DNA-Fragment namens DNA1 (Abb. 4a). DNA1 ist ein Nachahmer eines tRNAAsp-Fragments, das am häufigsten in sporenwandgebundener RNA vorkommt. Die Menge an Polynukleotiden, die an mit hohem Salzgehalt gewaschene Sporen gebunden waren, wurde durch Proteasebehandlung verringert (ergänzende Abbildung 6b), was mit der Hypothese übereinstimmt, dass Proteine ​​an der Polynukleotid-Bindungsmaschinerie beteiligt sind. Die Internalisierung von mit hohem Salzgehalt gewaschenen Sporen durch HEK293T-Zellen wurde durch die Bindung von tRNA und DNA1 verbessert (Abb. 4b). Wie bei Latexkügelchen band aus der Sporenwand stammende RNA effizienter an Sporen als andere Polynukleotide (Abb. 4a). Im Einklang mit der Hypothese, dass der Grad der Partikelinternalisierung durch HEK293T-Zellen im Verhältnis zur Menge der an die Partikel gebundenen Polynukleotide stand, wurden Sporen, die von der Sporenwand abgeleitete RNA adsorbiert hatten, effizienter internalisiert als Sporen, die vor ihrer Bindung andere Polynukleotide adsorbiert hatten gesättigt (Abb. 4b). Anschließend analysierten wir die Bindung eines anderen einzelsträngigen DNA-Fragments, das aus einer Sequenz bestand, die nicht mit tRNAs verwandt war (seine Sequenz ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt). Das DNA-Fragment wurde DNA2 genannt. DNA1 und DNA2 banden in ähnlichen Mengen an Sporen (ergänzende Abbildung 6b). Bemerkenswerterweise induzierten zwei DNA-Fragmente mit unterschiedlichen Sequenzen die Internalisierung von mit hohem Salzgehalt gewaschenen Sporen in vergleichbaren Mengen (Abb. 4c). Diese Ergebnisse legen insgesamt nahe, dass Polynukleotide als Liganden zur Auslösung der Phagozytose dienen und die Nukleotidsequenz für die Auslösung der Internalisierung durch kultivierte Zellen nicht entscheidend ist. Sporen werden von HEK293T-Zellen effizienter internalisiert als polynukleotidgebundene Latexkügelchen, möglicherweise weil Sporen mehr Liganden (RNA) als Latexkügelchen halten können (ergänzende Abbildung 6b). Zur weiteren Untermauerung dieser Hypothese zeigte ein kompetitiver Hemmungstest (Abb. 4d), dass die Zugabe freier Polynukleotide die Internalisierung von Sporen durch HEK293T-Zellen hemmte.

Als nächstes versuchten wir, den Rezeptor zu identifizieren, der die Internalisierung von Sporen in Säugetierzellen vermittelt. Da es sich bei Polynukleotiden höchstwahrscheinlich um Liganden handelt, wurden mehrere Rezeptoren, von denen bekannt ist, dass sie Polynukleotide binden18, 28, 29, 30, 31, 32, als Fusionen rot fluoreszierender Proteine ​​(RFP) in HEK293-Zellen (nicht HEK293T-Zellen) überexprimiert und auf ihre Auswirkungen auf die Sporeninternalisierung untersucht (Abb. 5a). In diesem Experiment wurden HEK293-Zellen verwendet, da diese Zelllinie eine geringere phagozytische Effizienz als HEK293T aufwies (Abb. 1c); Wir spekulierten, dass die Phagozytenwerte in HEK293 durch Überexpression des Rezeptors erhöht werden könnten. Wir fanden heraus, dass der Grad der Sporeninternalisierung durch die Expression von RAGE-RFP um mehr als das Doppelte erhöht wurde (Abb. 5a). Die Expressionsniveaus von RAGE-mRNA in HEK293T-Zellen waren ungefähr 1,5-fach höher als die in HEK293-Zellen (ergänzende Abbildung 7a). Die Sporeninternalisierung in HeLa- und HEK293T-Zellen wurde auch durch die Überexpression von RAGE verstärkt (ergänzende Abbildung 7b). In Übereinstimmung mit der Rolle von RAGE bei der Sporeninternalisierung war dieser Prozess in RAGE-Knockout-Zellen um das Zehnfache verringert (Abb. 5b). Der Verlust der RAGE-Expression in HEK293T RAGE KO-Zellen wurde durch Western-Blot-Analyse bestätigt (ergänzende Abbildung 7c). Das Ergebnis der FACS-Analyse zeigte auch, dass die Phagozytose von Sporen durch HEK293T durch RAGE KO verringert wurde (ergänzende Abbildung 7d). Darüber hinaus wurde der Defekt bei der Sporeninternalisierung in HEK293T RAGE KO-Zellen durch die Expression von RAGE-RFP behoben (Abb. 5b). Die Internalisierung von Polynukleotid-gebundenen Perlen war auch in HEK293T RAGE KO-Zellen verringert (Abb. 5c). Zusätzlich zu RAGE fanden wir heraus, dass die Internalisierung von Sporen in HEK293-Zellen auch durch Überexpression des Toll-like-Rezeptors 3 (TLR3) erhöht wurde (Abb. 5a). Der Grad der Sporeninternalisierung in HEK293T-Zellen wurde jedoch durch TLR3-Knockout nicht verändert (ergänzende Abbildung 7e), was zeigt, dass dieser Rezeptor entweder nicht für die Sporeninternalisierung erforderlich ist oder mit einem anderen Rezeptor, der die gleiche Funktion erfüllt, redundant ist. Daher wird TLR3 hier nicht weiter betrachtet.

a Linkes Feld: Internalisierung von Sporen in HEK293-Zellen, die die angegebenen RFP-Fusionen oder RFP allein exprimieren. Rechtes Feld: Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Anti-RFP-Antikörpers zur Überprüfung der Expression der RFP-Fusionen. Aktin wird als Ladekontrolle verwendet. b Internalisierung von Sporen in HEK293T (wt) oder HEK293T RAGE KO-Zellen, die die angegebenen RFP-Fusionen exprimieren. c Internalisierung von Latexkügelchen in Wildtyp-HEK293T- oder HEK293T-RAGE-KO-Zellen. Die angegebenen polynukleotidgebundenen Latexkügelchen wurden mit Wildtyp-HEK293T- oder HEK293T-RAGE-KO-Zellen inkubiert. d Oberes Feld: Gereinigtes RAGE1–341-His-FLAG wurde einer SDS-PAGE-Analyse unterzogen und mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Unteres Feld: Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten von Cy3-RNA, präzipitiert mit RAGE1–341-His-FLAG, befestigt an Agarosekügelchen oder bloßen Agarosekügelchen (Kontrolle). e Linkes Feld: Bindung von RAGE1–341-His-FLAG an tRNA-gebundene Latexkügelchen. RAGE1–341-His-FLAG wurde mit tRNA-gebundenen Perlen oder bloßen Perlen (Perlen) inkubiert und das mit den Perlen präzipitierte Protein wurde mittels Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Anti-His-Tag-Antikörpers nachgewiesen. Rechtes Feld: Quantifizierung von RAGE1–341-His-FLAG, präzipitiert mit tRNA-gebundenen Perlen oder bloßen Perlen (Bead). Es wurden relative Intensitäten von RAGE1–341-His-FLAG, die mit den Perlen ausgefällt wurden, gezeigt. Die Intensität von RAGE1–341-His-FLAG, präzipitiert mit bloßen Perlen, wurde als 1 definiert. f Der Internalisierungsprozess von Sporen in HEK293T-Zellen, gefolgt von Zeitraffermikroskopie. HEK293T-Zellen, die vorübergehend RAGE-GFP exprimieren, wurden mit LysoTracker Red (Lysosom) vorinkubiert und dann mit Sporen inkubiert. Es werden repräsentative Bilder einer Spore gezeigt, die internalisiert wird (Pfeil). Maßstabsbalken, 10 µm. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (a–e) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests bestimmt. n = 3. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns nicht signifikant (P ≥ 0,05).

RAGE verfügt über zwei Polynukleotidbindungsstellen, die als Site 1 und Site 218 bezeichnet werden. Sporeninternalisierung in HEK293T RAGE KO-Zellen, die RAGE-RFPs exprimieren, die Mutationen in einer der Nukleotidbindungsstellen beherbergen (bezeichnet als RAGEmut1-RFP bzw. RAGEmut2-RFP). war niedriger als bei Zellen, die RAGE-RFP exprimieren (Abb. 5b). Um die Bindung zwischen RAGE und RNA weiter zu analysieren, führten wir In-vitro-Bindungstests durch. Die extrazelluläre Region von RAGE (Aminosäuren 1–341), fusioniert mit FLAG und His-Tags, wurde in HEK293-Zellen exprimiert; die verkürzte RAGE wurde RAGE1–341-His-FLAG genannt. Gereinigtes RAGE1–341-His-FLAG wurde an Agarosekügelchen gebunden, die mit einem Anti-FLAG-Tag-Antikörper konjugiert waren, und mit einem RNA-Fragment (einem Nachahmer von DNA1) inkubiert, das an Cyanin 3 (Cy3) fusioniert war. Wie in Abb. 5d gezeigt, ist das RNA-Fragment an die extrazelluläre Region von RAGE gebunden. Darüber hinaus stellten wir fest, dass RAGE1–341-His-FLAG mit tRNA-gebundenen Latexkügelchen stärker präzipitiert wurde als mit bloßen Latexkügelchen (Abb. 5e). Diese Ergebnisse zeigen, dass RNA direkt an RAGE bindet. Das vorhergesagte Molekulargewicht von RAGE1–341-His-FLAG beträgt 40,7 kDa. Das durch SDS-PAGE nachgewiesene gereinigte RAGE1–341-His-FLAG (Abb. 5d) war größer als das vorhergesagte Molekulargewicht (Abb. 5d), vermutlich weil RAGE zwei N-verknüpfte Glykosylierungsstellen aufweist.

Um die Lokalisierung von RAGE während der Sporeninternalisierung zu beurteilen, führten wir eine Zeitraffermikroskopie durch. Diese Analyse zeigte, dass die Spore vor ihrer Internalisierung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) umhüllt war, das an RAGE fusioniert war (Abb. 5f und Zusatzvideo 1). RAGE-GFP wurde zusammen mit den Sporen internalisiert und später wurden die GFP-Fusions- und Sporen enthaltenden Kompartimente mit LysoTracker angefärbt (Abb. 5f und Zusatzvideo 1). Die Fluoreszenzintensitäten von RFP in bestimmten Bereichen in Phagozytenbechern (Plasmamembran, die Sporen umhüllt) waren höher als in Bereichen neben dem Phagozytenbecher in der Plasmamembran in fixierten Zellen (ergänzende Abbildung 7f, g). Dieses Ergebnis legt nahe, dass RAGE-RFP in phagozytische Becher rekrutiert wird. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Sporen über RAGE-vermittelte Phagozytose internalisiert werden.

RAGE wird im Vergleich zu anderen Organen hauptsächlich in der Lunge ausgedrückt33,34. Um zu beurteilen, ob RAGE-vermittelte Phagozytose in vivo auftritt, wurde ein Sporeninternalisierungstest mit primären Alveolartyp-II-Epithelzellen (ATII) der Maus durchgeführt. Sporen wurden von primären ATII-Zellen internalisiert (Abb. 6a, b). Die Internalisierung von Sporen in ATII-Zellen wurde durch Reagenzien oder Mutationen gehemmt, die die Sporeninternalisierung in HEK293T-Zellen ebenfalls beeinträchtigten (Abb. 6b – d). Um festzustellen, ob Rage (das Maushomolog) für die Sporeninternalisierung in ATII-Zellen erforderlich ist, wurde ein durch RNA-Interferenz (RNAi) vermittelter Rage-Knockdown durchgeführt. Eine quantitative Echtzeit-PCR-Analyse (qRT-PCR) zeigte, dass die Spiegel des Maus-Rage-Transkripts durch die Transfektion von ATII-Zellen mit kleinen interferierenden RNAs (siRNAs), die auf Rage abzielen, verringert wurden (Abb. 6e, linkes Feld). Dementsprechend war der Grad der Sporeninternalisierung durch die Mauszellen in Rage-Knockdown-Zellen im Vergleich zu Kontroll-ATII-Zellen verringert (Abb. 6e, rechtes Feld). Dieses Ergebnis legt nahe, dass RAGE-vermittelte Phagozytose in verschiedenen Kernkraftwerken auftritt.

a Repräsentative Bilder von ATII-Zellen mit internalisierten Sporen. Die Bilder wurden mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) oder Fluoreszenzmikroskopie (Sporen und Lysosom) aufgenommen. Lysosomen wurden mit LysoTracker Red gefärbt. Maßstabsbalken, 20 µm. b Internalisierung von Wildtyp- (wt) oder dit1∆-Sporen in ATII-Zellen. Wildtyp- (wt) oder dit1∆-Sporen ohne jegliche Behandlung (−), Wildtyp-Sporen, die mit Protease oder RNase A (RNase) behandelt wurden, wurden mit ATII-Zellen inkubiert. c Internalisierung von Sporen in ATII-Zellen, die mit oder ohne (Kontrolle) Piceatannol (PT) oder Wortmannin (WTM) behandelt wurden. d Sporeninternalisierung in ATII-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit (Kontrolle) von DNA1. e Linkes Feld: Spiegel der Rage-mRNA in primären Maus-ATII-Zellen, transfiziert mit zwei Rage-targeting-siRNAs (siRNA1 und siRNA2) oder einer nicht-targeting-siRNA-Kontrolle (nc). Dargestellt sind die Verhältnisse der Rage-mRNA-Spiegel in Zellen, die mit auf Rage gerichteten siRNAs transfiziert wurden, zu denen in Zellen, die mit nc transfiziert wurden. Rechtes Feld: Internalisierung von Sporen in Rage-Knockdown- und NC-transfizierten ATII-Zellen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (b–e) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests bestimmt. n = 3. **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.

Da es sich bei RAGE um einen Multiligand-Rezeptor handelt, haben wir untersucht, ob die RAGE-vermittelte Phagozytose durch einen anderen Liganden, HMGB1, induziert wird. HMGB1-gebundene Latexkügelchen (HMGB1-Kügelchen) wurden durch Vernetzung von rekombinantem HMGB1 mit Latexkügelchen hergestellt. Die Internalisierung von Latexkügelchen wurde durch die Bindung von HMGB1 an die Kügelchen verdreifacht (Abb. 7a, b und ergänzende Abb. 8a, b). Im Vergleich zu Wildtyp-HEK293T-Zellen war der Internalisierungsgrad von HMGB1-Kügelchen in RAGE-KO-Zellen verringert (Abb. 7b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass HMGB1 die Phagozytose durch NPPs induziert.

a Repräsentative Bilder von Zellen mit internalisierten Latexkügelchen. Bei HMGB1- oder Histonkügelchen waren 49,57 bzw. 44,40 fg/Kügelchen der Proteine ​​an Latexkügelchen gebunden. Bei DNA/HMGB1- oder DNA/Histon-Kügelchen wurden 65,94 bzw. 61,39 fg/Kügelchen der Proteine ​​an DNA-Kügelchen gebunden (die Menge der gebundenen DNA1 betrug 1,27 fg/Kügelchen). Die Bilder wurden mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) oder Fluoreszenzmikroskopie (Sporen und Lysosom) aufgenommen. Lysosomen wurden mit LysoTracker Red gefärbt. Maßstabsbalken, 10 µm. b Internalisierung von Latexkügelchen in HEK293T- oder HEK293T RAGE KO-Zellen. Nackte Latexkügelchen (Kontrolle) oder die angegebenen Kügelchen wurden mit HEK293T- oder HEK293T RAGE KO-Zellen inkubiert. Für BSA-Perlen: 48,02 fg/Perle der proteingebundenen Latexkügelchen. c Internalisierung von Latexkügelchen in ATII-Zellen. Die angegebenen Arten von Latexkügelchen wurden mit primären Maus-ATII-Zellen inkubiert. d Internalisierung von Latexkügelchen in ATII-Zellen, die mit Rage-Targeting-siRNAs transfiziert wurden. ATII-Zellen wurden mit zwei Rage-Targeting-siRNAs (siRNA1 und siRNA2) oder einer nicht-Targeting-siRNA-Kontrolle (nc) transfiziert. Diese Zellen wurden mit den angegebenen Perlen wie in a beschrieben inkubiert. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (b–d) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests bestimmt. n = 3 (b–d). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001; ns nicht signifikant (P ≥ 0,05).

Wie bei polynukleotidgebundenen Latexkügelchen war der Grad der Internalisierung von HMGB1-gebundenen Kügelchen geringer als der von Sporen (vergleiche Abb. 2a (Kontrolle) und Abb. 7b (DNA und HMGB1)). Wie bereits beschrieben, kann dieser Unterschied darauf hinweisen, dass Sporen eine höhere Ligandendichte (RNA) aufweisen als Latexkügelchen (ergänzende Abbildung 6b). Zusätzlich oder alternativ kann die Sporenwand andere Substanzen enthalten, die die Internalisierung verstärken oder aktiv induzieren können. Im Hinblick auf die letztgenannte Möglichkeit zeigte eine frühere Studie, dass die RAGE-vermittelte Entzündungsreaktion synergistisch durch DNA und HMGB135 aktiviert wird. Analog dazu stellten wir fest, dass die Internalisierung von DNA- und HMGB1-gebundenen (doppelt markierten) Kügelchen (DNA/HMGB1-Kügelchen) durch HEK293T-Zellen höher war als die, die mit DNA- oder HMGB1-Kügelchen (d. h. einfach markierten Partikeln) beobachtet wurde (Abb. 7a, b). Für diesen Test wurden DNA/HMGB1-Kügelchen durch Adsorption von HMGB1 an DNA-Kügelchen hergestellt. In DNA/HMGB1-Kügelchen schien HMGB1 an DNA auf Latexkügelchen zu binden, da HMGB1 nicht von bloßen Kügelchen adsorbiert wurde (ergänzende Abbildung 8c). Der Grad der Internalisierung von DNA-Kügelchen durch HEK293T-Zellen wurde durch die Bindung von HMGB1 erhöht (ergänzende Abbildungen 8c, d). Der Grad der Internalisierung von DNA/HMGB1-Kügelchen durch HEK293T RAGE KO-Zellen war geringer (Abb. 7b). Somit verstärken DNA und HMGB1 synergistisch die RAGE-vermittelte Phagozytose.

Dann führten wir ein ähnliches Experiment mit einem anderen DNA-bindenden Protein, Histon, durch. Es ist bekannt, dass extrazelluläre Histone als DAMPs fungieren36, es wurde jedoch zuvor berichtet, dass sie nicht als Liganden für RAGE dienen. Daher verwendeten wir zunächst Histone als Negativkontrolle. Allerdings wurden Histon-markierte Kügelchen in HEK293T-Zellen in einer Menge internalisiert, die etwa doppelt so hoch war wie die von DNA/HMGB1-Kügelchen (Abb. 7a, b und ergänzende Abb. 9a, b). Im Gegensatz dazu wurden mit Rinderserumalbumin (BSA) markierte Kügelchen nicht in HEK293T-Zellen internalisiert (Abb. 7b), was zeigt, dass RAGE-vermittelte Phagozytose im Allgemeinen nicht durch Proteine ​​induziert wird. Bemerkenswerterweise wurde die Internalisierung von Histonkügelchen durch RAGE-Knockout verringert (Abb. 7b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Histone ein weiterer Ligand für RAGE sind. Zur Untermauerung dieser Hypothese wurde RAGE-GFP mit Histonkügelchen, jedoch nicht mit BSA-Kügelchen, aus einem Zelllysat präzipitiert, das das RAGE-GFP-Fusionsprotein enthielt (ergänzende Abbildung 9c). Wie bei HMGB1 zu sehen ist, wurde die Internalisierung von DNA-Kügelchen durch die zusätzliche Bindung von Histonen verbessert (Abb. 7a, b und ergänzende Abb. 9d, e). In HEK293T RAGE KO-Zellen war die Internalisierung der DNA/Histon-Kügelchen verringert (Abb. 7b). Histonkügelchen und DNA/Histonkügelchen wurden auch von Maus-ATII-Zellen internalisiert (Abb. 7c). Wir stellen jedoch fest, dass die Internalisierung von Perlen durch ATII-Zellen nicht durch HMGB1 induziert wurde (Abb. 7c). Darüber hinaus waren primäre Maus-ATII-Zellen im Gegensatz zu HEK293T-Zellen bei der Internalisierung von Sporen effizienter als alle modifizierten künstlichen Kügelchen (vergleiche Abb. 6c (Kontrolle) und Abb. 7c). Dennoch wurde die Internalisierung von DNA/Histon-Kügelchen oder Histon-Kügelchen durch ATII-Zellen durch den Abbau von Rage verringert (Abb. 7d), was zeigt, dass die Internalisierung der Kügelchen durch diese primären Mauszellen durch Rage-abhängige Phagozytose vermittelt wird.

Schließlich untersuchten wir, ob RAGE für HEK293T-Zellen erforderlich ist, um apoptotische Zellen zu internalisieren, die bekannte Ziele für die Phagozytose durch NPPs in vivo2 sind. Jurkat-Zellen wurden in HEK293T-Zellen internalisiert, als sie mit dem Apoptose-Induktor Staurosporin behandelt wurden (Abb. 8a, b). In HEK293T RAGE KO-Zellen war der Grad der Internalisierung von mit Staurosporin behandelten Jurkat-Zellen jedoch etwa viermal niedriger als in Wildtyp-Zellen (Abb. 8b). Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Größe der in HEK293T RAGE KO-Zellen internalisierten Jurkat-Zellen (Fragmente) kleiner war als die in Wildtyp-Zellen internalisierten (Abb. 8c). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Efferozytose durch NPPs auch durch einen RAGE-abhängigen Weg vermittelt wird.

a Repräsentative Bilder von HEK293T- oder HEK293T-RAGE-KO-Zellen mit internalisierten apoptotischen Jurkat-Zellen, die GFP exprimieren, erhalten mit Differential-Interferenzkontrast (DIC) oder Fluoreszenzmikroskopie (apoptotische Zelle und Lysosom). Lysosomen wurden mit LysoTracker Red gefärbt. Maßstabsbalken, 10 µm. b Internalisierung apoptotischer Jurkat-Zellen in HEK293T- oder HEK293T RAGE KO-Zellen. Apoptotische Zellen wurden mit HEK293T- oder HEK293T-RAGE-KO-Zellen bei 106 Jurkat-Zellen/4–6 × 105 Wildtyp- oder RAGE-KO-Zellen/ml inkubiert. n = 3. c Verteilung der Größe der Jurkat-Zelle (Fragment), internalisiert in HEK293T- (n = 50) oder HEK293T RAGE KO-Zellen (n = 50). Die Größe wurde durch Messung der längsten Abmessung der internalisierten Zellen bestimmt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM (b) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde durch zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests (b, c) bestimmt. **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.

Phagozytose kommt in Kernkraftwerken3 vor; Der Mechanismus ist jedoch nicht klar. Hier zeigen wir, dass die Phagozytose durch KKW durch RAGE vermittelt wird. Angesichts der Tatsache, dass RAGE-Knockout-Zellen eine Restaktivität zur Internalisierung von Partikeln in Mikrogröße aufweisen, können KKW mit mehreren Phagozytosewegen ausgestattet sein. Dennoch können NPPs aufgrund der Multiligandenerkennungseigenschaft des Rezeptors verschiedene Moleküle über den RAGE-vermittelten Weg phagozytieren.

Es ist bekannt, dass KKW in vivo eine Efferozytose durchführen2. Wir zeigen, dass RAGE die Beseitigung apoptotischer Leichen vermitteln kann; vermutlich dient PS auf apoptotischen Zellen als Ligand für diesen Prozess. Abgesehen von Zellkadavern waren die Ziele für die Phagozytose durch NPPs in vivo nicht klar. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass verschiedene Makromoleküle, die RAGE-Liganden enthalten, von NPPs phagozytiert werden. Es ist bekannt, dass Makromoleküle, die RAGE-Liganden enthalten, im extrazellulären Raum vorhanden sind37,38. Beispielsweise können an Histone oder HMGB1 gebundene DNA-Fragmente aus geschädigten Zellen freigesetzt werden. Diese Moleküle sind potenzielle Ziele für die RAGE-vermittelte Phagozytose. Interessanterweise sind die meisten, wenn nicht alle RAGE-Liganden schädliche Moleküle39,40. Der zugrunde liegende Mechanismus, wie RAGE mehrere schädliche Liganden erkennen kann, bedarf jedoch einer weiteren Strukturanalyse.

Eine direkte Bindung zwischen RAGE und seinen Liganden wurde in früheren Berichten nachgewiesen28,35; Bei der RAGE-vermittelten Phagozytose induziert ihre Bindung höchstwahrscheinlich den Signalweg. Wir fanden heraus, dass die Internalisierung von Polynukleotid-gebundenen Latexkügelchen durch die Bindung anderer DNA-bindender RAGE-Liganden verstärkt wurde. Der synergistische Effekt spiegelt möglicherweise die Tatsache wider, dass der DNA/HMGB1-Komplex mit höherer Affinität an RAGE bindet als DNA oder HMGB1 allein, wie bereits berichtet wurde35. Unsere pharmakologische Analyse legt nahe, dass SYK und PI3K am Signalweg beteiligt sind. Diese Kinasen sind als nachgeschaltete Signalmoleküle bei der Fcγ-Rezeptor-vermittelten Phagozytose bekannt1, was auf eine Ähnlichkeit zwischen professionellen und nicht professionellen Phagozytosewegen hinweist. Der Fcγ-Rezeptor verfügt über ein Immunrezeptor-Tyrosin-basiertes Aktivierungsmotiv (ITAM) in der zytosolischen Domäne1. SYK bindet über das phosphorylierte ITAM-Motiv direkt an den aktivierten Fcγ-Rezeptor. Im Gegensatz zum Fcγ-Rezeptor fehlt das ITAM-Motiv jedoch in der zytosolischen Domäne von RAGE. Daher kann die Aktivierung der RAGE-vermittelten phagozytischen Signalübertragung ein Adapterprotein oder einen Korezeptor umfassen. Bemerkenswert ist, dass HEK293T- und Maus-Primär-ATII-Zellen Partikel mit unterschiedlichen Präferenzen internalisieren; HEK293T-Zellen phagozytieren DNA/Histon-Kügelchen am effizientesten, während ATII-Zellen Sporen bevorzugen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Internalisierungseffizienz nicht ausschließlich durch die Affinität von RAGE zu Partikeln bestimmt wird. Somit kann die Internalisierungseffizienz durch einen oder mehrere zusätzliche Korezeptoren vermittelt werden.

Während wir uns in diesem Bericht auf den Mechanismus der Phagozytose durch Kernkraftwerke konzentrieren, liefert unsere Studie auch einige interessante Erkenntnisse aus mikrobiologischer Sicht. Insbesondere fanden wir heraus, dass RNA-Fragmente an die Sporenwand binden. Die Sporenwand ist mit einer Maschinerie zur Aufnahme von RNA ausgestattet, was darauf hindeutet, dass RNA-Fragmente für Sporen von Vorteil sein könnten. Da S. cerevisiae eine nicht pathogene Hefe ist, ist es unwahrscheinlich, dass sporenwandgebundene RNA eine invasive Maschinerie darstellt. Abgesehen von der Sporenwand wird über das Vorhandensein extrazellulärer RNA oder DNA in mehreren biologischen Strukturen berichtet, darunter in extrazellulären Neutrophilenfallen und Biofilmen41,42. In diesen Strukturen werden extrazelluläre Polynukleotide als Materialien zum Schutz von Zellen oder Organismen verwendet. Analog dazu schlagen wir vor, dass sporenwandgebundene RNA eine Schutzfunktion hat. Da sich im Zytosol Sporen bilden, wäre es sinnvoll, ansonsten nutzlose RNA-Fragmente als Schutzmaterialien zu verwenden. Daher wäre es interessant zu beurteilen, ob RNA in der Sporenwand anderer Organismen enthalten ist. In der Hefesporenwand sind aus unbekannten Gründen tRNA-Fragmente, insbesondere tRNAAsp-Fragmente, in sporenwandgebundener RNA konzentriert. In Zellkulturen und Bioflüssigkeiten von Säugetieren sind Fragmente von tRNAGly und tRNAGlu wichtige nichtvesikuläre extrazelluläre RNAs, da sie RNase-resistente Formen annehmen43. In Hefe kann tRNAAsp daher gegenüber der RNase-Verdauung im Ascal-Zytosol resistent sein. Alternativ kann die Verzerrung auf die Bindungsspezifität der in der Sporenwand vorhandenen RNA-Bindungsmaschinerie zurückzuführen sein.

Hefesporen weisen einzigartige Eigenschaften auf, da sie von NPPs weitaus effizienter internalisiert werden als Polynukleotid-gebundene Latexkügelchen. Es gibt zwei Möglichkeiten, die effiziente Phagozytose von Sporen zu erklären. Zum einen könnten Sporen mehr Polynukleotide aufnehmen als Latexkügelchen mit Oberflächenamingruppen. Die andere Möglichkeit besteht darin, dass zusätzliche Moleküle, die an die RNA an der Sporenwand gebunden sind, die Internalisierungseffizienz verbessern könnten, obwohl die Identität eines solchen Moleküls derzeit noch unklar ist. Die RNA-Bindungsmaschinerie in der Sporenwand wäre nicht nur aus mikrobiologischer Sicht interessant, sondern auch für die Entwicklung von Transportsystemen für Säugetierzellen.

Es ist bekannt, dass RAGE an einer Reihe von Erkrankungen beteiligt ist44,45,46. Die Aktivierung von RAGE kann Entzündungsreaktionen auslösen, und es wird berichtet, dass viele Erkrankungen mit RAGE-vermittelten chronischen Entzündungen in Zusammenhang stehen. Dennoch könnten einige Störungen, wie z. B. Infektionskrankheiten, mit der Funktion von RAGE als phagozytischer Rezeptor zusammenhängen. RAGE ist in der Lunge stark ausgeprägt, wo Epithelzellen auf eine Vielzahl von Mikroorganismen treffen47. Da Hefesporen in Kernkraftwerken phagozytiert werden, können andere Mikroorganismen über RAGE-vermittelte Phagozytose in Epithelgewebe internalisiert werden. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, dass verschiedene Bakterien Biofilme bilden, die Polynukleotide enthalten. In Mausmodellen wurde über Auswirkungen von RAGE bei Infektionskrankheiten berichtet. Interessanterweise kann RAGE abhängig von den pathologischen Organismen und Zuständen entweder positive oder schädliche Auswirkungen haben44. Unterschiedliche Ergebnisse können auf die Toleranz des Erregers gegenüber endozytären Kompartimenten in Kernkraftwerken zurückzuführen sein; Bei einigen Krankheitserregern wäre der phagozytische Prozess hilfreich für die Wirtsinvasion. Diese Hypothese wird dadurch gestützt, dass in HEK293T-Zellen internalisierte Sporen am Leben sind und mit der Keimung beginnen, was zum Absterben der kultivierten Zellen führt.

Da Kernkraftwerke nicht mit mikrobiziden Mechanismen ausgestattet sind, sind sie im Vergleich zu professionellen Fresszellen anfällig für Krankheitserreger. Professionelle Fresszellen leisten daher eine bessere Leistung bei der Beseitigung von Krankheitserregern. Insbesondere zeigte eine frühere Studie, dass die phagozytische Aktivität in Kernkraftwerken durch IGF-1 unterdrückt wird, das von professionellen Phagozyten freigesetzt wird48. Diese Kreuzregulierung kann hilfreich sein, um die Ausbreitung von Krankheitserregern zu verhindern. NPPs und professionelle Phagozyten können auf verschiedene Weise interagieren und zur Entwicklung und Erhaltung von Geweben sowie zur Krankheitsreaktion beitragen. Wir hoffen, dass unsere Ergebnisse den Weg für weitere Analysen und Einblicke in die physiologischen Rollen der Phagozytose durch KKW ebnen.

HEK293T-, HEK293-, HeLa- und HUC-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen. Diese Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Biological Industries) kultiviert, das 10 % (v/v) fötales Kälberserum (FCS) (Biological Industries) enthielt. Die Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten. Primäre ATII-Zellen der Maus wurden von Procell gekauft und in ATII-Zellspezialmedium (Procell) kultiviert. Jurkat-Zellen wurden von ATCC erhalten und im Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Biological Industries) mit 10 % (v/v) FCS kultiviert. FCS wurde durch 45-minütige Inkubation bei 56 °C vor der Zugabe zum Medium inaktiviert. Jurkat-Zellen, die GFP stabil exprimieren, wurden in RPMI 1640 mit 10 % (v/v) FCS und 5 μg/ml Blasticidin (InvivoGen) kultiviert. Die Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C gehalten.

Die in dieser Studie verwendeten Hefestämme sind AN120 (Wildtyp) (MATα/MATa ARG4/arg4-NspI his3∆SK/his3∆SK ho::LYS2/ho::LYS2 leu2/leu2 lys2/lys2 RME1/rme1:: LEU2 trp1::hisG/trp1::hisG ura3/ura3)49 und HW3 (dit1∆) (MATα/MATa ARG4/arg4-NspI his3∆SK/his3∆SK ho::LYS2/ho::LYS2 leu2/leu2 lys2 /lys2 RME1/rme1::LEU2 trp1::hisG/trp1::hisG ura3/ura3 dit1∆::his5+/dit1∆::his5+)50. Bei diesen Stämmen handelt es sich um SK-1-Hintergrundstämme, die mit hoher Effizienz sporulieren51. Um GFP in AN120 zu exprimieren, wurden die haploiden Stämme49 mit pRS306TEF-GFP, verdaut mit EcoRV, transformiert und die Transformanten gepaart.

Hefezellen wurden in YPAD (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 30 mg/l Adenin und 20 g/l Glucose) kultiviert. Zur Herstellung der Platten wurde Agar (20 g/l) zugesetzt. Hefezellen wurden wie zuvor beschrieben sporuliert50. Kurz gesagt, Hefezellen, die aus einer einzelnen Kolonie stammten, wurden über Nacht in 5 ml YPAD-Flüssigmedium kultiviert. Ein 0,1-ml-Aliquot der Kultur wurde in 5 ml YPAcatate (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton und 20 g/l Kaliumacetat) überführt und über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 2 % Kaliumacetatmedium bei einer Konzentration von 3 × 107 Zellen/ml resuspendiert und 24 Stunden lang kultiviert.

Um Sporen aus Asci freizusetzen, wurden die Asci in 5 ml Lyticase-Puffer suspendiert und 20 μl Lyticase-Stammlösung (Sigma-Aldrich) (10.000 U/ml wurden in 500 μl 50 % Glycerin gelöst) zugegeben. Nach einer dreistündigen Inkubation bei 37 °C wurden die Sporen zweimal mit Lyticase-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Sporen in Wasser resuspendiert und mit einem Ultraschalldisruptor (Xinchen Biological Technology) beschallt, um die Asci-Membran aufzubrechen. Die Beschallungsbedingungen waren wie folgt: Leistung 45 %; Dauer: 20 Minuten mit Zyklen von 5 Sekunden an und 2 Sekunden aus. Anschließend wurden die Sporen dreimal mit 0,5 % Tween-20 und zweimal mit Wasser gewaschen. Die Anzahl der Sporen wurde mit einem Thrombozytenzähler gezählt.

Mit hohem Salzgehalt gewaschene Sporen wurden durch 30-sekündige Inkubation der Sporen in 0,6 M NaCl-Lösung hergestellt und anschließend zweimal mit Wasser gewaschen. Um die Sporen mit RNase A oder DNase I zu behandeln, wurden 2 × 107 Sporen mit 3 U RNase A (TaKaRa) oder 3 U DNase I (Beyotime) in Wasser bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Die Sporen wurden zweimal mit Wasser gewaschen. Um mit Proteinase behandelte Sporen herzustellen, wurden 2 × 107 Sporen mit 2 U Proteinase (Sigma-Aldrich) in Wasser bei 37 °C 30 Minuten lang inkubiert und zweimal mit Wasser gewaschen.

Alle in dieser Studie verwendeten Oligonukleotide und Plasmide sind in den Ergänzungstabellen 1 bzw. 2 aufgeführt. Für das CRISPR-Cas9-System, das zum Ausschalten von Zielgenen verwendet wird, wurden Leit-RNA-Sequenzen mithilfe der E-CRISP-Website52 (RRID:SCR_019088) entworfen und die entsprechenden DNA-Fragmente in den BpiI-verdauten Vektor pX330EGFP-hU6-gRNA-hSpCas953 ligiert. Die RAGE- und SYK-cDNA-Fragmente wurden aus cDNA amplifiziert, die von HEK293T-Zellen stammte, und in die pME-tagRFP- oder pME-mEGFP-Vektoren kloniert54, um pME-RAGE-tagRFP, pME-RAGE-mEGFP und pME-SYK-mEGFP zu erzeugen. RAGE-Mutanten mit DNA-Bindungsstelle wurden mit PCR-basierter ortsgerichteter Mutagenese konstruiert. pME-Hyg-3FLAG54 wurde zum Klonen von RAGE1–341-His-FLAG verwendet. Die Sequenzen der Primer, die zur Einführung der Mutationen verwendet wurden, sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Das TLR3-cDNA-Fragment wurde aus menschlicher cDNA amplifiziert, die von HEK293T-Zellen stammt. TLR7- und TLR8-cDNA-Fragmente wurden aus menschlicher cDNA amplifiziert, die aus THP1-Zellen stammte. TLR9 wurde aus einem menschlichen UltimateTM-ORF-Klon (Klon Nr. IOH21944) amplifiziert. Um das Hefe-GFP-Expressionsplasmid pRS306TEF-GFP zu konstruieren, wurde GFP durch PCR unter Verwendung von pFA6a-GFP (S65T)-HIS3MX655 als Matrize amplifiziert. Der TEF2-Promotor und der CYC1-Terminator wurden aus pRS316TEF56 erhalten. pLIB2-mEGFP-BSD wurde verwendet, um Jurkat-Zellen herzustellen, die GFP stabil exprimieren. Das GFP (mEGFP) wurde aus pME-mEGFP verdaut.

Für die Plasmid-DNA-Transfektion wurden die Zellen bis zu einer Konfluenz von 60 % in Objektträgern mit 24 Vertiefungen gezüchtet und mit Plasmid-DNA (0,8 μg/Vertiefung) unter Verwendung von Lipofectamine™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert.

Eine Retrovirus-basierte Transfektion57 wurde verwendet, um Jurkat-Zellen zu konstruieren, die GFP stabil exprimieren. HEK293T-Zellen (106) wurden mit 1 μg pGP, 1 μg pLC-VSVG und 2 μg pLIB2-mEGFP-BSD unter Verwendung von Lipofectamine™ 2000 gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Nach 36-stündiger Inkubation wurde das Medium mit einem 0,22-μm-Filter filtriert und mit der gleichen Menge DMEM, ergänzt mit 16 μg/ml Hexadimethrinbromid (Sigma), gemischt. Das Retrovirus enthaltende Medium wurde über Nacht mit Jurkat-Zellen inkubiert. Nach 5 Tagen Kultur wurden die GFP exprimierenden Zellen mit einem Zellsortierer S3e (Bio-Rad) sortiert.

Ein rundes Glasdeckglas (14 mm Durchmesser) wurde auf den Boden von 24-Well-Platten gelegt. Zellen (1,5 × 105/Well) wurden in die Platte gesät und man ließ sie bis zu einer Dichte von 2–3 × 105/Well wachsen. Die Zellen wurden mit 0,6 × 107 Sporen 12 Stunden lang bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS (Sangon Biotech) wurden die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 10 μM Propidiumiodid gefärbt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die toten Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop gezählt.

Um die RAGE-Knockout-Zelllinie zu erzeugen, wurden HEK293T-Zellen vorübergehend mit zwei Plasmiden, pX330-RAGE-gRNA1 und pX330-RAGE-gRNA2 (Ergänzungstabelle 2), transfiziert, die die folgenden gRNAs trugen, die auf die Exonregionen des RAGE-Gens abzielten: pX330-RAGE-gRNA1 , CAAGAAACCACCCCAGCGGC; pX330-RAGE gRNA2, TCTTACGGTAGACACGGACT. Nach 3 Tagen Inkubation wurden die EGFP exprimierenden Zellen mit einem Zellsortierer S3e (Bio-Rad) sortiert. Anschließend wurden die gesammelten Zellen 8 Tage lang kultiviert und einer limitierenden Verdünnung unterzogen, um RAGE-Knockout-Klonkandidaten zu erhalten. Klone, denen die Wildtyp-Allele der Zielregion fehlen, wurden durch PCR unter Verwendung der Primer RAGE check F1 und RAGE check R1 (Ergänzungstabelle 1) ausgewählt, und positive Klone wurden mit DNA-Sequenzen unter Verwendung der Sanger-Methode weiter verifiziert. Die TLR3-Knockout-Zelllinie wurde auf ähnliche Weise unter Verwendung von pX330-TLR3-gRNA1 und pX330-TLR3-gRNA2 erzeugt. Die Sequenzen der in pX330-TLR3 gRNA1 und pX330-TLR3 gRNA2 ligierten gRNAs sind GTACCTGAGTCAACTTCAGG bzw. GCCTTGTATCTACTTTTGGG. PCR-Primer, die zur Auswahl von Klonen verwendet wurden, denen die Wildtyp-Allele der Zielregion fehlen, waren TLR3-Check F1 und TLR3-Check R1 (Ergänzungstabelle 1). Die SYK-Knockout-Zelllinie wurde auf ähnliche Weise unter Verwendung von pX330-SYK-gRNA1 und pX330-SYK-gRNA2 erzeugt. Die Sequenzen der in pX330-SYK-gRNA1 und pX330-SYK-gRNA2 ligierten gRNAs lauten GGCAGAAGATTACCTGGTCC bzw. GCTTCTTGAGGAGGCAGACC. PCR-Primer, die zur Auswahl von Klonen verwendet wurden, denen die Wildtyp-Allele der Zielregion fehlen, waren SYK-Check F1 und SYK-Check R1 (Ergänzungstabelle 1).

Die Unterdrückung von Rage in Maus-ATII-Zellen wurde durch RNA-Interferenz (RNAi) mit kleiner interferierender RNA (siRNA) durchgeführt. Eine siRNA (siRNA1) wurde von Santa Cruz Biotechnology gekauft und die andere siRNA (siRNA2) (Sense, 5'-3' GCACUUAGAUGGGAAACUUTT und Antisense, 5'-3' AAGUUUCCCAUCUAAGUGCTT) wurde von GenePharma gekauft. ATII-Zellen (2,5 × 104) wurden in 24-Zellen-Platten ausgesät und 20 Stunden lang kultiviert; Anschließend wurden 20 pmol siRNA mit GenMuteTM siRNA-Transfektionsreagenz (SignaGen) gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert. Die Sequenzen der nicht zielgerichteten siRNAs waren wie folgt: Sense 5′-3′ UUCUCCGAACGUGUCACGUTT; Antisense 5′-3′ ACGUGACACGUUCGGAGAATT. Nach 36-stündiger Inkubation wurden die Zellen einer qRT-PCR oder einem Sporen- oder Latexkügelchen-Internalisierungstest unterzogen.

Die RNA wurde aus jeder Zelle mithilfe des CellAmpTM Direct RNA Prep Kit für RT-PCR (TaKaRa) isoliert. Erststrang-cDNA wurde mit PrimeScriptTM RT Master Mix (TaKaRa) synthetisiert. Die Reaktion wurde in einer 20-µl-Reaktionsmischung durchgeführt. cDNAs wurden bei –20 ° C gelagert. Für die qRT-PCR wurde das Reaktionsgemisch mit TB Green® Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa) gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet und die PCR mit einem Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) durchgeführt. Die für die PCR verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Die PCR wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 30 s bei 95 °C, 5 s bei 40 Zyklen bei 95 °C und 30 s bei 60 °C, gefolgt von einem Standard-Dissoziationslauf um Schmelzkurvenprofile der Amplifikate zu erhalten. Mithilfe der 2-ddCt-Methode wurde die relative interne mRNA-Expression von Zielgenen auf GAPDH normalisiert.

Etwa 5 × 108 in Wasser suspendierte Sporen wurden 60 Minuten lang bei 62 °C inkubiert. Um die Lebensfähigkeit der Sporen zu testen, wurden 3 × 107 Sporen auf die YPAD-Platte getupft und 2 Tage lang bei 30 °C inkubiert.

Zur Expression und Reinigung von RAGE1–341-His-FLAG wurde pME-Hyg-RAGE1–341-His-FLAG in HEK293-Zellen transfiziert, die in 15-cm-Schalen kultiviert wurden. Nach 12 Stunden Inkubation wurde das Medium ausgetauscht und die Zellen wurden 36 Stunden lang weiter kultiviert. Das Medium wurde gesammelt und 3 Minuten lang bei 3000 × g zentrifugiert, um Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Anschließend wurde das Medium durch eine Hochleistungs-His-Trap-Säule (GE Healthcare) geleitet. Die Säule wurde mit PBS gewaschen und RAGE1–341-His-FLAG wurde mit Elutionspuffer (200 mM Imidazol) eluiert. Für den Pulldown von RAGE1–341-His-FLAG mit tRNA-gebundenen Perlen wurde das verkürzte RAGE mit Anti-FLAG M2-Affinitätsagaroseperlen (Sigma-Aldrich) weiter gereinigt. 1 ml der aus RAGE1–341-His-FLAG eluierten Hochleistungs-His-Trap-Säule wurde mit 50 µl Anti-FLAG-M2-Affinitätsagarosekügelchen (Sigma-Aldrich) gemischt, mit PBS vorgewaschen und 2 Stunden lang bei 4 °C rotiert. Die Agarosekügelchen wurden viermal mit PBS gewaschen und das rekombinante RAGE1–341-His-FLAG wurde mit PBS, das 500 µg/ml FLAG-Peptid enthielt, eluiert.

Ein rundes Glasdeckglas (14 mm Durchmesser) wurde auf den Boden von 24-Well-Platten gelegt. Zellen (1,5 × 105/Well) wurden in die Platte ausgesät und man ließ sie bis zu einer Dichte von 2–3 × 105 Zellen/Well wachsen. Der Assay wurde in 500 µl Kulturmedium, ergänzt mit 0,025 µl LysoTracker (Beyotime), durchgeführt. Säugetierzellen und gereinigte Sporen oder Latexkügelchen (2 µm Durchmesser, Sigma-Aldrich) wurden 1 Stunde lang in einem CO2-Inkubator bei 37 °C inkubiert. Sofern nicht anders angegeben, wurden Sporen oder Latexkügelchen mit kultivierten Zellen bei 1,2 × 107 Sporen oder Kügelchen/4–6 × 105 kultivierten Zellen/ml in DMEM, ergänzt mit LysoTracker, inkubiert. Anschließend wurden die Zellen auf Eis gelegt, zweimal mit PBS gewaschen und intrazelluläre Sporen oder Perlen unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Für RFP- oder RFP-Fusion exprimierende Zellen (Abb. 5a, b und ergänzende Abb. 7b) wurden mindestens 50 kultivierte Zellen analysiert. Für den anderen Test wurden mindestens 100 kultivierte Zellen analysiert. Sporen, die in LysoTracker-positiven Kompartimenten beobachtet wurden, wurden als internalisierte Partikel definiert. Für den kompetitiven Hemmungstest mit Polynukleotiden wurde dem Testmedium vor der Zugabe der Sporen RNA oder DNA in einer Konzentration von 90 µg/ml zugesetzt. Wortmannin, Piceatannol oder Latrunculin A wurden 30 Minuten vor der Zugabe der Sporen oder Perlen in einer Endkonzentration von 100 nM, 50 μM bzw. 10 nM zugegeben.

Für die Analyse der Größe internalisierter Sporen wurde die NIS-Element AR-Software (Nikon) verwendet, um die längste Dimension der Sporen zu messen. Vierzig Sporen wurden analysiert.

Zellen (2 × 105/Well) wurden in 12-Well-Platten ausgesät und man ließ sie bis zu einer Dichte von 4–6 × 105 Zellen/Well wachsen. Die Zellen wurden mit 1,2 × 107 Sporen, die GFP exprimierten, 1 Stunde lang in einem CO2-Inkubator bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 5 Minuten lang mit Trypsin behandelt und zweimal mit PBS gewaschen. Die Proben wurden mit BD FACS AriaIII (BD) analysiert. Die Daten wurden mit FlowJo X (BD) analysiert.

Jurkat-Zellen wurden aus der Kultur geerntet und in einer Dichte von 106/ml in RPMI 1640 mit 10 % FCS resuspendiert. Apoptose wurde 12 Stunden lang mit 1,0 μM Staurosporin (Beyotime) induziert. Nach 12-stündiger Inkubation wurden apoptotische Zellen 3 Minuten lang bei 4 ° C und 860 × g zentrifugiert und zweimal mit PBS gewaschen.

Ein rundes Glasdeckglas (14 mm Durchmesser) wurde auf den Boden von 24-Well-Platten gelegt. HEK293T- oder HEK293T-RAGE-KO-Zellen (1,5 × 105/Well) wurden in die Platte mit 500 µl DMEM ausgesät und konnten bis zu einer Dichte von 2–3 × 105 Zellen/Well wachsen. Der Kultur wurden apoptotische Jurkat-Zellen in einer Menge von 106 apoptotischen Zellen/4–6 × 105 Wildtyp- oder RAGE-KO-Zellen/ml zugesetzt. Nach 2-stündiger Inkubation in einem CO2-Inkubator bei 37 °C wurden 0,025 µl LysoTracker Red zum Kulturmedium gegeben und 10 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen auf Eis gelegt, zweimal mit PBS gewaschen und intrazelluläre apoptotische Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Apoptotische Zellen mit grüner Fluoreszenz, die in LysoTracker-positiven Kompartimenten in HEK293T- oder HEK293T RAGE KO-Zellen beobachtet wurden, wurden als internalisierte apoptotische Zellen definiert. Für den Test wurden mindestens 300 kultivierte Zellen analysiert. Die NIS-Element AR-Software (Nikon) wurde verwendet, um die Größe (die längste Dimension internalisierter Zellen) apoptotischer Zellen im Lysosom zu analysieren.

Insgesamt 2 × 108 Sporen, suspendiert in 500 µl 0,6 M NaCl, wurden 30 s lang bei Raumtemperatur verwirbelt. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 21.500 × g und 4 °C wurde die RNA aus dem Überstand mit RNAiso plus (TaKaRa) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die RNA-Konzentration wurde mit einem NanoDrop 2000/2000c (Thermo Fisher Scientific) gemessen.

Sporenwandgebundene RNA wurde wie oben beschrieben hergestellt. Die RNA-Sequenzierung wurde von Genesky Biotechnologies durchgeführt. Die RNA-Probe wurde auf den Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) aufgetragen, um ihre Größenverteilung zu analysieren (ergänzende Abbildung 10a). Die RNA-Probe (ohne Fragmentierung) wurde mit Illumina-Adaptern (120 nt) ligiert, um Zielligationsprodukte zu bilden, und cDNAs wurden durch reverse Transkription erzeugt. Anschließend wurden die cDNA-Fragmente mittels PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden einer 6% igen Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um Ziel-DNA-Fragmente und Adapter zu trennen (ergänzende Abbildung 10b). Basierend auf dem Bioanalyzer-Ergebnis wurde das im Polyacrylamidgel zwischen 140 und 250 bp nachgewiesene Abstrich-DNA-Signal ausgeschnitten und DNA-Fragmente aus dem Gel gewonnen. Die DNA-Fragmente wurden auf einem Illumina MiSeq Benchtop Sequencer (Illumina) sequenziert. Die Sequenzdaten wurden in der NCBI Sequence Read Archive-Datenbank mit der Zugangsnummer PRJNA748575 hinterlegt. Die Verteilung der RNA-Länge wurde mit FastQC58 analysiert.

Paired-End-MiSeq-Reads wurden durch den Adapter getrimmt (Trimmomatic59) und überlappende Paired-End-Reads wurden mit PEAR60 zusammengeführt. Die Lesevorgänge wurden mithilfe von BWA-MEM61 auf das Genom abgebildet, und der Anteil der Lesevorgänge, die jeder Genklasse zugeordnet waren, wurde mithilfe der GFF-Datei (Spalte 3) aus der R64-Genomfreigabe von SGD62 bestimmt.

Zur Herstellung von Polynukleotid-gebundenen, mit Salz gewaschenen Sporen wurden die Sporen einmal mit 0,6 M NaCl und zweimal mit Wasser gewaschen. Insgesamt 2 × 108 Sporen, suspendiert in 1 ml Wasser, wurden mit Polynukleotiden 24 Stunden lang bei 4 °C unter Rotation inkubiert. Anschließend wurden die Sporen 5 Minuten lang bei 4 °C und 1000 × g zentrifugiert und zweimal mit Wasser gewaschen. Die Anzahl der Sporen wurde mit einem Thrombozytenzähler gezählt.

Zur Herstellung DNA-gebundener Latexkügelchen wurden 40 μl Latexkügelchen zweimal mit Wasser gewaschen. Insgesamt 2 × 108 in Wasser suspendierte Perlen wurden mit Sporenwand-RNA, tRNA (Sigma-Aldrich) oder DNA1 unter Rotation bei 4 °C 24 Stunden lang inkubiert. Die Anzahl der Perlen wurde mit einem Thrombozytenzähler gezählt. Anschließend wurden die Perlen 5 Minuten lang bei 4 °C und 21.500 × g zentrifugiert und zweimal mit Wasser gewaschen. Zur Herstellung von DNA-Kügelchen (DNA1-gebundene Kügelchen) wurden 2 × 108 Latexkügelchen mit 200 ng DNA1 in 1 ml Wasser bei 4 °C für 24 Stunden inkubiert und wie oben beschrieben gewaschen.

Um die Mengen an an Sporen oder Perlen gebundenen Polynukleotiden zu messen, wurden an Polynukleotide gebundene Sporen oder Perlen in 200 µl 0,6 M NaCl suspendiert und 30 s lang bei Raumtemperatur verwirbelt. Anschließend wurden die Sporen oder Perlen 5 Minuten lang bei 21.500 × g und 4 °C zentrifugiert. Die RNA wurde aus dem Überstand mit RNAiso plus gereinigt. Die DNA wurde durch Isopropanol-Fällung gereinigt. Die RNA- bzw. DNA-Konzentration wurde mit einem NanoDrop 2000/2000c gemessen.

Um DNA/HMGB1- oder DNA/Histon-Kügelchen zu erzeugen, wurden 108 DNA-gebundene Kügelchen, suspendiert in 55 μl Wasser, mit HMGB1 (Sangon Biotech) oder Histon (Sangon Biotech) unter Rotation bei 4 °C für 24 Stunden inkubiert. Die Perlen wurden 5 Minuten lang bei 4 °C und 21.500 × g zentrifugiert und zweimal mit Wasser gewaschen. Die an die Kügelchen gebundene Proteinmenge wurde durch Subtrahieren der restlichen Proteinmenge von der ursprünglichen Menge bestimmt. Zur Messung der Proteinmengen wurde ein BCA-Kit (Beyotime) verwendet. Um HMGB1-, Histon- oder BSA-gebundene Latexkügelchen zu erzeugen, wurden zunächst 2 × 108 Latexkügelchen in 500 µl Wasser, ergänzt mit 4 % Glutaraldehyd (Aladdin), 2 Stunden lang bei 30 °C inkubiert und zweimal mit Wasser gewaschen. Insgesamt 108 Glutaraldehyd-modifizierte Perlen wurden mit HMGB1, Histon oder BSA (Sangon Biotech) in 55 μl Wasser bei 4 °C 24 Stunden lang unter Rotation inkubiert. Anschließend wurden die Perlen zweimal mit Wasser gewaschen.

Zur Herstellung von tRNA-gebundenen Perlen wurden 2 × 108 Latexperlen mit 200 ng tRNA in 1 ml Wasser bei 4 °C 24 Stunden lang inkubiert und zweimal mit Wasser gewaschen. Siebenhundert Mikrogramm gereinigtes RAGE1–341-His-FLAG (nach Reinigung mit Anti-FLAG-M2-Affinitätsagarosekügelchen) wurden mit 1,5 × 108 bloßen Kügelchen oder tRNA-gebundenen Kügelchen in 50 µl PBS bei 4 °C für 2 Stunden unter Rotation inkubiert . Anschließend wurden die Perlen dreimal mit PBS gewaschen. Das an den Perlen befestigte Protein wurde durch Kochen in 50 µl SDS-Probenpuffer eluiert und 10 µl der Proben wurden durch Western Blot analysiert.

Ein Milliliter des von der Hochleistungs-His-Trap-Säule eluierten RAGE1–341-His-FLAG wurde mit 50 µl vorgewaschenen Anti-FLAG-M2-Affinitätsagarosekügelchen (Sigma-Aldrich) inkubiert, um das verkürzte RAGE an die Agarosekügelchen zu binden. Die Perlen wurden dreimal mit PBS gewaschen und in 50 µl RNase-freiem Wasser suspendiert. Dann wurden 20 µl RAGE1–341-His-FLAG-gebundene Agarosekügelchen mit 1,5 µg RNA gemischt, die am 5′-Ende mit Cyanin 3 (Cy3) fusioniert war und in 60 µl RNase-freiem Wasser suspendiert war. Die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit RNase-freiem Wasser wurden die Perlen in 200 µl RNase-freiem Wasser suspendiert und 150 µl der Probe zur Fluoreszenzquantifizierung auf den Multimode-Mikroplattenleser Synergy H4 Hybrid mit 570-nm-Anregung und 650-nm-Emission aufgetragen .

Insgesamt 6 × 108 Latexkügelchen wurden zweimal mit Wasser gewaschen und mit 4 % Glutaraldehyd 2 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 21.500 × g und 4 °C wurden die Perlen zweimal mit Wasser gewaschen. Glutaraldehydmodifizierte Perlen (3 × 108) wurden mit 80 µg Histon oder BSA bei 4 °C in 100 µl Wasser 12 Stunden lang unter Rotation inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit Wasser wurden die Perlen 1 Stunde lang mit 10 % BSA bei 4 °C inkubiert, um freies Glutaraldehyd zu blockieren.

In 6-cm-Schalen kultivierte HEK293T-Zellen wurden mit pME-mEGFP oder pME-RAGE-mEGFP unter Verwendung von Lipofectamine 2000 transfiziert und 36 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 500 μl Lysepuffer (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 % NP40), ergänzt mit 5 μl EDTA-freien Proteaseinhibitor-Cocktails (MCE), 30 Minuten lang auf Eis inkubiert Mindest. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 21.500 × g und 4 °C wurden 100 μl des Überstands mit 1,5 × 108 Histon- oder BSA-gebundenen Perlen unter Rotation inkubiert. Anschließend wurden die Perlen viermal mit Lysepuffer gewaschen. Die an den Perlen befestigten Proteine ​​wurden durch Kochen in 50 µl SDS-Probenpuffer (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 2 % SDS, 0,1 % Bromphenolblau, 10 % Glycerin und 1 % 1-Mercapto-11-hydroxy-) eluiert. 3,6,9-Trioxaundecan) und 10 µl der Proben wurden mittels Western Blot analysiert. Ein Prozent des Lysats nach der Zentrifugation wurde als Eingangsprobe für das Western Blot verwendet.

Um endogenes RAGE nachzuweisen, wurden in 10-cm-Schalen kultivierte HEK293T- und HEK293T-RAGE-KO-Zellen in 500 μl Homogenisierungspuffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 0,22 M Mannitol und 0,07 M Saccharose) suspendiert, ergänzt mit 5 μl EDTA-freier Protease Inhibitor-Cocktails (MCE). Die Zellen wurden 40 Mal auf Eis homogenisiert. Die Homogenate wurden in 1,5-ml-Röhrchen überführt und 5 Minuten lang bei 4 °C und 1000 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden 1 Stunde lang bei 4 °C mit 100.000 × g weiter zentrifugiert. Die Pellets wurden in 100 μl Homogenisierungspuffer resuspendiert. Anschließend wurden 10 μl der mit SDS-Probenpuffer gemischten Proben gekocht und einer 10 %igen SDS-PAGE unterzogen. Um eine Beladungskontrolle, GLUT1, nachzuweisen, wurden 10 μl der Proben ohne Kochen einer 10 % SDS-PAGE unterzogen.

Um die Fusion von tagRFP mit RAGE, TLR3, TLR7, TLR8 und TLR9 nachzuweisen, wurden HEK293-Zellen suspendiert, die die Plasmide pME-TLR3-tagRFP, pME-TLR7-tagRFP, pME-TLR8-tagRFP oder pME-TLR9-tagRFP enthielten 500 μl Lysepuffer, ergänzt mit Protease-Inhibitor-Cocktails, auf Eis für 30 Minuten. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 21.500 × g und 4 °C wurden 20 µg dieser Proben in einem SDS-Probenpuffer suspendiert. Nachdem die Proben gekocht wurden, wurden sie einer 6 %igen SDS-PAGE unterzogen. Nach der SDS-PAGE wurden die Proteine ​​auf PVDF-Membranen (Bio-Rad) übertragen. Die Membranen wurden in 5 % Milch (Sangon Biotech) in TBST-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,05 % (v/v) Tween-20) blockiert und mit den entsprechenden in QuickBlockTM verdünnten Antikörpern sondiert Primärer Antikörper-Verdünnungspuffer (Beyotime) für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurden die Membranen mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern, verdünnt in 5 % Milch in TBST-Puffer, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal in TBST-Puffer gewaschen. Die folgenden Primärantikörper wurden verwendet: Kaninchen-Anti-RAGE (Abcam, 1: 2000); Kaninchen-Anti-SYK (Abcam, 1:3000); Kaninchen-Anti-RFP (InvivoGen, 1:3000); Maus-Anti-GFP (TransGen Biotech, 1:3000); Kaninchen-Anti-GLUT1 (Abcam, 1:4000); Maus-Anti-Aktin (TransGen Biotech, 1:3000); Maus-Anti-His (TransGen Biotech, 1:5000). Primärantikörper wurden mithilfe des sekundären Anti-Maus-IgG-HRP-gekoppelten Antikörpers (TransGen Biotech, 1:5000) oder des Anti-Kaninchen-IgG-HRP-gekoppelten Antikörpers (TransGen Biotech, 1:5000) nachgewiesen. Die Signale wurden mit ECL-Substrat (Bio-Rad) erfasst. Die Bilder wurden mit einem automatischen Chemilumineszenz-Bildanalysesystem Tanon 5200 aufgenommen.

Mikroskopiebilder wurden mit einem inversen Nikon C2 Eclipse Ti-E-Mikroskop mit einer DS-Ri-Kamera (Live-Bildgebung und Hefebilder) oder einem inversen konfokalen Nikon C2 Eclipse Ti-E-Laser-Scanning-Mikroskop (die anderen Bilder), ausgestattet mit NIS-Element, aufgenommen AR-Software.

Für die Live-Bildgebung wurden vorübergehend mit RAGE-mEGFP transfizierte Zellen auf Glasbodenschalen mit 1,5 ml DMEM kultiviert. Als die Zelldichte eine Konfluenz von ~80 % erreichte, wurden 0,06 µl LysoTracker Red zum Kulturmedium gegeben und 20 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurde das Kulturmedium durch vorgewärmte, mit DMEM ergänzte Sporen (1,5 × 107/ml) ausgetauscht. Nach 20-minütiger Inkubation wurde die Schale einer Live-Bildgebung unterzogen.

Die quantitative Analyse von RAGE-RFP im Phagozytenbecher und in der Plasmamembran wurde wie folgt durchgeführt. RAGE-RFP exprimierende HEK293T-Zellen wurden mit Sporen (1,2 × 107 Sporen/4–6 × 105 kultivierte Zellen/ml) 40 Minuten lang inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % (Vol./Vol.) Paraformaldehyd fixiert. Die fixierten Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Die Fluoreszenzintensitäten wurden in bestimmten ausgewählten Bereichen (32 × 55 Pixel) im Phagozytenbecher (Plasmamembran, die die Sporen umhüllt) und in den Bereichen neben jedem Phagozytenbecher gemessen. Die mittleren Pixelintensitäten der ausgewählten Bereiche wurden mit der NIS-Element AR-Software ermittelt.

Die statistische Analyse der Daten wurde mit der GraphPad Prism 8-Software (GraphPad Software) durchgeführt. Alle Werte werden als Mittelwerte ± SEM (n wie in den Legenden der Abbildungen angegeben) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen, ungepaarten Student-T-Test bestimmt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationen verfügbar. Die RNA-Sequenzierungsdaten wurden in der NCBI Sequence Read Archive-Datenbank (Zugangsnummer PRJNA748575) hinterlegt. Die Quelldaten der in den Abbildungen dargestellten Grafiken sind in den Zusatzdaten 1 verfügbar. Unbearbeitete Immunoblots und Gele werden als Zusatzabbildungen bereitgestellt. 11–13 in der Zusatzinformationsdatei. Weitere relevante Daten waren auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Flannagan, RS, Jaumouillé, V. & Grinstein, S. Die Zellbiologie der Phagozytose. Annu. Rev. Pathol. 7, 61–98 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Seeberg, JC et al. Nicht-professionelle Phagozytose: ein allgemeines Merkmal normaler Gewebezellen. Wissenschaft. Rep. 9, 11875 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Rabinovitch, M. Professionelle und nicht-professionelle Phagozyten: eine Einführung. Trends Zellbiol. 5, 85–87 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wakefield, JSJ & Hicks, RM Erythrophagozytose durch die Epithelzellen der Blase. J. Cell Sci. 15, 555–573 (1974).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Goldman, R. Lektin-vermittelte Anheftung und Aufnahme von Hefezellen und Erythrozyten durch Hamsterfibroblasten. Exp. Zellauflösung 104, 325–334 (1977).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wood, W. et al. Mesenchymale Zellen verschlingen und beseitigen apoptotische Fußplattenzellen in makrophagenlosen PU.1-Nullmausembryonen. Entwicklung 127, 5245–5252 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lacy-Hulbert, A. in Phagozytose sterbender Zellen: Von molekularen Mechanismen zu menschlichen Krankheiten (Hrsg. Krysko, DV & Vandenabeele, P.) (Springer, 2009).

Freeman, SA & Grinstein, S. Phagozytose: Rezeptoren, Signalintegration und das Zytoskelett. Immunol. Rev. 262, 193–215 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pauwels, AM, Trost, M., Beyaert, R. & Hoffmann, E. Muster, Rezeptoren und Signale: Regulierung der Phagosomenreifung. Trends Immunol. 38, 407–422 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, G., Gao, X.-D. & Nakanishi, H. Einzigartige Eigenschaften der Sporenwand von S. cerevisiae und ihre Anwendungen. Trends Glycosci. Glykotechnol. 32, E189–E193 (2020).

Artikel Google Scholar

Kupiec, M., Byers, B., Esposito, RE & Mitchell, AP in The Molecular and Cell Biology of the Yeast Saccharomyces (Hrsg. Pringle, JR, Broach, JR & Jones, EW) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997) .

Neiman, AM Ascosporenbildung in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Mikrobiol. Mol. Biol. Rev. 69, 565–584 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brown, HE, Esher, SK & Alspaugh, JA Chitin: eine „verborgene Figur“ in der Pilzzellwand. Curr. Spitze. Mikrobiol. Immunol. 425, 83–111 (2020).

CAS PubMed Google Scholar

Felder, T. et al. Dtrlp, ein Multiresistenztransporter der Major-Facilitator-Superfamilie, spielt eine wesentliche Rolle bei der Sporenwandreifung in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryoten. Zelle 1, 799–810 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Briza, P., Kalchhauser, H., Pittenauer, E., Allmaier, G. & Breitenbach, M. N,N'-Bisformyldityrosin ist ein In-vivo-Vorläufer der Hefe-Ascosporenwand. EUR. J. Biochem. 239, 124–131 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schmidt, AM et al. Isolierung und Charakterisierung von zwei Bindungsproteinen für Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung aus Rinderlunge, die auf der Endothelzelloberfläche vorhanden sind. J. Biol. Chem. 267, 14987–14997 (1992).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Neeper, M. et al. Klonierung und Expression eines Zelloberflächenrezeptors für Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung von Proteinen. J. Biol. Chem. 267, 14998–15004 (1992).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sirois, CM et al. RAGE ist ein Nukleinsäurerezeptor, der Entzündungsreaktionen auf DNA fördert. J. Exp. Med. 210, 2447–2463 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

He, M. et al. Der Rezeptor für Endprodukte der fortgeschrittenen Glykierung bindet an Phosphatidylserin und unterstützt die Clearance apoptotischer Zellen. EMBO Rep. 12, 358–364 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hori, O. et al. Der Rezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) ist eine zelluläre Bindungsstelle für Amphoterin. Vermittlung des Neuritenwachstums und Koexpression von Wut und Amphoterin im sich entwickelnden Nervensystem. J. Biol. Chem. 270, 25752–25761 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chavakis, T., Bierhaus, A. & Nawroth, PP RAGE (Rezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte): ein zentraler Akteur bei der Entzündungsreaktion. Mikroben infizieren. 6, 1219–1225 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hudson, BI & Lippman, ME Targeting der RAGE-Signalisierung bei entzündlichen Erkrankungen. Annu. Rev. Med. 69, 349–364 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xu, J. et al. Makrophagen-Endozytose der Gruppe 1 mit hoher Mobilität löst Pyroptose aus. Zelltod ist unterschiedlich. 21, 1229–1239 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Briza, P., Breitenbach, M., Ellinger, A. & Segall, J. Isolierung von zwei entwicklungsregulierten Genen, die an der Sporenwandreifung in Saccharomyces cerevisiae beteiligt sind. Genes Dev. 4, 1775–1789 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Oliveira, CA, Kashman, Y. & Mantovani, B. Auswirkungen von Latrunculin A auf die immunologische Phagozytose und die mit der Makrophagenausbreitung verbundenen Veränderungen im F-Actin/G-Actin-Gehalt der Zellen. Chem. Biol. Interagieren. 100, 141–153 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Crowley, MT et al. Syk spielt eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion und Phagozytose, die durch Fcgamma-Rezeptoren auf Makrophagen vermittelt wird. J. Exp. Med. 186, 1027–1039 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Araki, N., Johnson, MT & Swanson, JA Eine Rolle der Phosphoinositid-3-Kinase bei der Vervollständigung der Makropinozytose und Phagozytose durch Makrophagen. J. Cell Biol. 135, 1249–1260 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Park, H., Adsit, FG & Boyington, JC Die 1,5-A-Kristallstruktur der Ektodomänen des menschlichen Rezeptors für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) zeigt einzigartige Merkmale, die die Ligandenbindung bestimmen. J. Biol. Chem. 285, 40762–40770 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alexopoulou, L., Holt, AC, Medzhitov, R. & Flavell, RA Erkennung doppelsträngiger RNA und Aktivierung von NF-kappaB durch Toll-like-Rezeptor 3. Nature 413, 732–738 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Heil, F. et al. Speziesspezifische Erkennung einzelsträngiger RNA über Toll-like-Rezeptor 7 und 8. Science 303, 1526–1529 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hemmi, H. et al. Ein Toll-like-Rezeptor erkennt bakterielle DNA. Natur 408, 740–745 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Pathogenerkennung und angeborene Immunität. Zelle 124, 783–801 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brett, J. et al. Untersuchung der Verteilung eines neu charakterisierten Rezeptors für fortgeschrittene Glykationsendprodukte in Geweben. Bin. J. Pathol. 143, 1699–1712 (1993).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katsuoka, F. et al. Alveolarepithelzellen vom Typ II in der Lunge exprimieren den Rezeptor für das RAGE-Gen (Advanced Glycation End Products). Biochem. Biophys. Res. Komm. 238, 512–516 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tian, ​​J. et al. Die Toll-like-Rezeptor-9-abhängige Aktivierung durch DNA-haltige Immunkomplexe wird durch HMGB1 und RAGE vermittelt. Nat. Immunol. 8, 487–496 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Marsman, G., Zeerleder, S. & Luken, BM Extrazelluläre Histone, zellfreie DNA oder Nukleosomen: Unterschiede in der Immunstimulation. Zelltod-Dis. 7, e2518 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Klune, JR, Dhupar, R., Cardinal, J., Billiar, TR & Tsung, A. HMGB1: endogene Gefahrensignalisierung. Mol. Med. 14, 476–484 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Silk, E., Zhao, H., Weng, H. & Ma, D. Die Rolle von extrazellulärem Histon bei Organverletzungen. Zelltod-Dis. 8, e2812–e2812 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gong, T., Liu, L., Jiang, W. & Zhou, R. DAMP-Sensing-Rezeptoren bei sterilen Entzündungen und entzündlichen Erkrankungen. Nat. Rev. Immunol. 20, 95–112 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Seong, S.-Y. & Matzinger, P. Hydrophobie: ein altes, mit Schäden verbundenes molekulares Muster, das angeborene Immunantworten auslöst. Nat. Rev. Immunol. 4, 469–478 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brinkmann, V. et al. Extrazelluläre Neutrophilenfallen töten Bakterien. Wissenschaft 303, 1532–1535 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Karygianni, L., Ren, Z., Koo, H. & Thurnheer, T. Biofilm-Matrixom: extrazelluläre Komponenten in strukturierten mikrobiellen Gemeinschaften. Trends Mikrobiol. 28, 668–681 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tosar, JP et al. Die Fragmentierung extrazellulärer Ribosomen und tRNAs formt das extrazelluläre RNAom. Nukleinsäuren Res. 48, 12874–12888 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van Zoelen, MAD, Achouiti, A. & van der Poll, T. Die Rolle des Rezeptors für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) bei Infektionen. Krit. Pflege 15, 208–208 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramasamy, R., Yan, SF & Schmidt, AM Rezeptor für AGE (RAGE): Signalmechanismen in der Pathogenese von Diabetes und seinen Komplikationen. Ann. N. Y. Acad. Wissenschaft. 1243, 88–102 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Oczypok, EA, Perkins, TN & Oury, TD Der ganze „RAGE“ bei Lungenerkrankungen: Der Rezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) ist ein wichtiger Mediator pulmonaler Entzündungsreaktionen. Pädiatr. Atmung. Rev. 23, 40–49 (2017).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Man, WH, de Steenhuijsen Piters, WAA & Bogaert, D. Die Mikrobiota der Atemwege: Torwächter für die Gesundheit der Atemwege. Nat. Rev. Microbiol. 15, 259–270 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Han, CZ et al. Makrophagen leiten die Phagozytose durch nichtprofessionelle Phagozyten um und beeinflussen Entzündungen. Natur 539, 570–574 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Neiman, AM, Katz, L. & Brennwald, PJ Identifizierung von Domänen, die für die entwicklungsbedingt regulierte SNARE-Funktion in Saccharomyces cerevisiae erforderlich sind. Genetics 155, 1643–1655 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, H., Tachikawa, H., Gao, XD & Nakanishi, H. Angewandte Verwendung von Hefesporen als Chitosan-Perlen. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 80, 5098–5105 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Kane, SM & Roth, R. Kohlenhydratstoffwechsel während der Ascosporenentwicklung in Hefe. J. Bakteriol. 118, 8–14 (1974).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heigwer, F., Kerr, G. & Boutros, M. E-CRISP: schnelle CRISPR-Zielortidentifizierung. Nat. Methoden 11, 122–123 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hirata, T. et al. Der anterograde Post-Golgi-Transport erfordert einen GARP-abhängigen retrograden Transport von Endosom zu TGN. Mol. Biol. Zelle 26, 3071–3084 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, SB, Dean, N., Gao, XD & Fujita, M. MON2 steuert den Wntless-Transport zum Golgi durch Recycling von Endosomen. Zellstruktur. Funktion. 45, 77–92 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Longtine, MS et al. Zusätzliche Module für die vielseitige und kostengünstige PCR-basierte Gendeletion und -modifikation in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14, 953–961 (1998).

3.0.CO;2-U" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-0061%28199807%2914%3A10%3C953%3A%3AAID-YEA293%3E3.0.CO%3B2-U" aria-label="Article reference 55" data-doi="10.1002/(SICI)1097-0061(199807)14:103.0.CO;2-U">Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mumberg, D., Muller, R. & Funk, M. Hefevektoren für die kontrollierte Expression heterologer Proteine ​​in unterschiedlichen genetischen Hintergründen. Gene 156, 119–122 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, S.-S. et al. Eine Knockout-Zellbibliothek von GPI-Biosynthesegenen für funktionelle Studien von GPI-verankerten Proteinen. Komm. Biol. 4, 777 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andrews, S. Ein Qualitätskontrolltool für Hochdurchsatz-Sequenzdaten [Online]. Online verfügbar unter: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).

Bolger, AM, Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: ein flexibler Trimmer für Illumina-Sequenzdaten. Bioinformatik 30, 2114–2120 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T. & Stamatakis, A. PEAR: eine schnelle und genaue Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatik 30, 614–620 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, H. Ausrichten von Sequenzlesevorgängen, Klonsequenzen und Assemblierungs-Contigs mit BWA-MEM. Vorabdruck bei arXiv:1303.3997 (2013).

Engel, SR et al. Die Referenzgenomsequenz von Saccharomyces cerevisiae: damals und heute. G3 4, 389–398 (2014).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

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Wir danken Aaron Neiman (Stony Brook University) für seine Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom Nationalen erstklassigen Disziplinprogramm für Technologie und Ingenieurwesen der Leichtindustrie (LITE2018-015), Projekt 111 (111-2-06), dem Collaborative Innovation Center of Jiangsu Modern Industrial Fermentation und dem International Joint Research Laboratory für die Produktion unterstützt von therapeutischen Glykoproteinen an der Jiangnan-Universität an X.-DG, Grundlagenforschungsfonds für die Zentraluniversitäten an HN (JUSRP51629B) und NSFC-Zuschüsse an HN (32071467) und X.-DG (21778023).

Schlüssellabor für Kohlenhydratchemie und Biotechnologie, Bildungsministerium, Fakultät für Biotechnologie, Jiangnan-Universität, Wuxi, 214122, China

Yan Yang, Guoyu Liu, Feng Li, Changjin Sun, Kaiping Ling, Morihisa Fujita, Xiao-Dong Gao und Hideki Nakanishi

Zentrum für quantitative Biologie und Peking-Tsinghua-Zentrum für Biowissenschaften, Akademie für fortgeschrittene interdisziplinäre Studien, Peking-Universität, Peking, 100871, China

Lucas B. Carey

Ginkgo Bioworks, Boston, MA, 02210, USA

Lucas B. Carey

Abteilung für Angewandte Biologische Chemie, Graduiertenschule für Agrar- und Biowissenschaften, Universität Tokio, Tokio, 113-8657, Japan

Hiroyuki Tachikawa

Collaborative Research Institute for Innovative Microbiology, Universität Tokio, Tokio, 113-8657, Japan

Hiroyuki Tachikawa

Institut für Glyco-Core-Forschung (iGCORE), Gifu-Universität, Gifu, 501-1193, Japan

Morihisa Fujita

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Konzeptualisierung, HN, HT und YY; Methodik, YY, HN und MF; Validierung, YY, GL und HN; formale Analyse, YY, LBC und HN; Untersuchung, YY, HN, GL, FL, CS und KL; Schreiben – ursprüngliche Entwurfsvorbereitung, YY und HN; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, HN, YY, HT, MF, FL und X.-DG; Betreuung und Finanzierungseinwerbung X.-DG und HN; Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Xiao-Dong Gao oder Hideki Nakanishi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Yong Jiang und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Jesmond Dalli und Manuel Breuer. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yang, Y., Liu, G., Li, F. et al. Der Rezeptor für fortgeschrittene Glykationsendprodukte (RAGE) vermittelt die Phagozytose in nicht professionellen Phagozyten. Commun Biol 5, 824 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03791-1

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Eingegangen: 30. Dezember 2021

Angenommen: 03. August 2022

Veröffentlicht: 16. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03791-1

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