Unterdrückung eines etablierten Hepatokarzinoms bei rein adjuvanter Immuntherapie: Alaun löst Anti aus

Aug 14, 2023

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 17695 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Die auf dendritischen Zellen basierende Immuntherapie ist eine neue Waffe in unserem Kampf gegen bösartige Erkrankungen beim Menschen. Jüngste Versuche am Menschen und Forschungsarbeiten an Modelltieren haben unterschiedliche Erfolgsgrade gezeigt, was auf ein großes Potenzial für den klinischen Einsatz schließen lässt. Obwohl die Protokolle unterschiedlich sind, umfasst ein gängiges Schema in dieser Behandlungskategorie die Aktivierung dendritischer Zellen mit dem Ziel, die Antigenpräsentation und die zelluläre Immunität zu erhöhen. Daher ist der richtige Einsatz von Immunadjuvans ein zentraler Gegenstand der Studie. Wir berichten hier über einen unerwarteten Befund, dass die Injektion von Alaun, dem am häufigsten verwendeten menschlichen Adjuvans, in Mäuse mit H22-Hepatokarzinom zu einer signifikanten Verringerung des Tumorwachstums und einer längeren Überlebenszeit der Tiere führte. Dieser Effekt war mit einer erhöhten spezifischen CD8+-T-Zellaktivierung und einem entzündlichen Milieu verbunden, jedoch mit minimalen offensichtlichen Nebenwirkungen. Unser Ergebnis legt nahe, dass die alleinige Verwendung von Adjuvans bei bestimmten etablierten Tumoren eine schützende Immunaktivierung des Wirts gegen dasselbe Ziel auslösen kann, was für unsere Entwicklung neuer Krebsimmuntherapien von Wert sein könnte.

Die Immuntherapie von Krebs gilt als einer der biomedizinischen Durchbrüche der letzten Jahre1. Das Ziel der Immuntherapie besteht darin, Immunreaktionen des Wirts hervorzurufen, um das Neoplasma zu kontrollieren und im optimalen Fall auszurotten. Dies ist im Gegensatz zur herkömmlichen Tumorbehandlung sicher und weist weniger Nebenwirkungen auf. Derzeit werden über tausend klinische Studien in dieser Kategorie durchgeführt2 (Daten entnommen aus www.clinicaltrials.gov). Unter diesen werden der adoptive Zelltransfer (ACT), die Immun-Checkpoint-Blockade und Impfstoffe auf der Basis dendritischer Zellen am intensivsten untersucht3,4,5.

Im Gegensatz zur prophylaktischen Impfung, bei der eine Immunantwort des Wirts in Vorbereitung auf künftige Begegnungen mit Infektionserregern induziert wird, besteht die Krebsimmuntherapie darin, den Toleranzzustand gegenüber Antigenen zu durchbrechen, die fälschlicherweise vorhanden sind oder in Tumorzellen übermäßig exprimiert werden6. ACT umfasst die In-vitro-Expansion von Wirts-T-Zellen, die durch Tumorantigene stimuliert werden, in Abwesenheit von In-vivo-Hemmfaktoren und die Reinfusion dieser Zellen in den Wirt zur Zytolyse und Apoptose-Induktion des Tumors7,8. Neuere Bemühungen nutzen biomedizinische Techniktechnologien, durch die Tumorantigen-spezifische Rezeptoren auf den infundierten Lymphozyten exprimiert werden, um eine robustere Erkennung zu ermöglichen9,10. Die Immun-Checkpoint-Blockade nutzt einige gängige Taktiken von Krebsgeweben, um sich vor der Erkennung durch das Immunsystem zu schützen, insbesondere durch die Signalisierung negativer Immunregulatoren auf der Zelloberfläche. Antikörper gegen CTLA-4 wurden erfolgreich bei der Behandlung von metastasiertem Melanom eingesetzt11,12,13. Die Blockierung der PD-1/PD-L1-Signalübertragung hat sich auch bei der Behandlung von Papillomavirus-induzierten bösartigen Läsionen und einer Reihe anderer solider Tumoren als äußerst wirksam erwiesen3,14. Obwohl diese Protokolle großes Potenzial bergen, sind sie nicht ungefährlich. ACT leidet unter Schwierigkeiten bei der Antigenidentifizierung und technischen Herausforderungen bei der Expansion von Immunzellen15,16, die Checkpoint-Blockade ist nur bei einer begrenzten Anzahl solider Tumoren anwendbar10 und wird häufig mit Autoimmunität, einschließlich Kolitis und Dermatitis, in Verbindung gebracht17,18. Die DC-basierte Immuntherapie, die darauf abzielt, die Intensität und Breite der Antigenpräsentation zu erhöhen, bleibt eine gültige Alternative.

Dendritische Zellen präsentieren den T-Zellen ständig endogene Wirtsantigene, die bei Fehlen eines Gefahrensignals als Mechanismus der peripheren Toleranzinduktion dienen19. In diesem Zusammenhang werden Tumorantigene vorgestellt. In der Tumorumgebung sind häufig zusätzliche negative Regulationen vorhanden, darunter tumorassoziierte Makrophagen und supprimierende Zytokine wie TGFβ20,21,22. In diesem Fall kommt dem Adjuvans eine entscheidende Bedeutung bei der Auslösung der Aktivierung von DCs23 zu. Durch TLRs/NLRs, Phagozytose-Induktion oder DC-Membranveränderung induzieren Adjuvantien häufig eine starke DC-Aktivierung, was zu einer robusten Antigenpräsentation, der Expression kostimulatorischer Moleküle und der Sekretion entzündlicher Zytokine führt24,25,26. DC-basierte Impfstoffe lassen sich grob in drei Kategorien einteilen. Aus dem Wirt isolierte oder/und in vitro expandierte DCs können in Gegenwart von Adjuvans mit Tumorantigenen (Epitoppeptiden oder autologen Tumorlysaten) beladen und in den Wirt reinfundiert werden27,28. Ein gezielterer Ansatz verwendet Tumorzellen, die so konstruiert sind, dass sie GM-CSF exprimieren, um DCs in vivo spezifisch anzulocken29. In jüngerer Zeit wurden Tumorantigene mit Antikörpern fusioniert, die spezifisch DC-Oberflächenmarker wie DEC205, DNGR1, CD40 usw. erkennen, um ein besseres Targeting zu ermöglichen und oft eine Immunantwort ohne zusätzliches Adjuvans zu erreichen30,31,32. Das einfachste/passivste Protokoll verwendet Tumorantigene gemischt mit Adjuvans in der Hoffnung, dass DCs diese Antigene bei Stimulation einfangen und präsentieren würden33,34. Da Antigene aus etablierten Tumoren ständig von DCs präsentiert werden, was bei fehlender DC-Aktivierung zu einer Immuntoleranz führt, kann eine ordnungsgemäße Stimulation von DCs theoretisch die Hemmung umkehren und eine Tumorimmunität hervorrufen.

Wir berichten hier über einen unerwarteten Befund, dass bei Balb/c-Mäusen mit einem etablierten H22-Hepatokarzinom ein Protokoll wiederholter Alauninjektionen eine tumorspezifische Immunantwort hervorrief, die das Tumorwachstum und die Mortalität signifikant hemmte. Diese Reaktion war entscheidend vom adoptiven Immunsystem abhängig, insbesondere von CD8+ T-Zellen und in geringerem Maße von Neutrophilen. Wichtig ist, dass dieses Protokoll kaum systemische Entzündungen und Gewebeschäden auslöste. Unsere Ergebnisse legen daher nahe, dass die alleinige Verabreichung von Adjuvans bei tumortragenden Wirten zu einer Tumorsuppression führen kann, wahrscheinlich über eine unspezifische Aktivierung von DCs. Da Alaun ein gut verträgliches Adjuvans ist, deuten unsere Ergebnisse auf seinen möglichen Einsatz bei der Tumorbehandlung hin.

Bei unseren Versuchen, Alaun als Adjuvans zur Verstärkung der Antitumorreaktion gegen eine Balb/c-Hepatomlinie H22 zu beobachten, die ursprünglich anhand eines lymphatischen Metastasenmodells35 etabliert wurde, immunisierten wir H22-tumortragende Mäuse mit verschiedenen isogenen Tumorzelllysaten in Kombination mit Alaun, um sie nachzuweisen jegliche mögliche therapeutische Wirkung. Wir stellten eine gelegentliche Verringerung der Tumorgröße in der Alaun-Monogruppe in Abwesenheit von Tumorantigen (Tumorlysat) fest. Um ein Protokoll zur konsistenteren Erfassung dieses Effekts zu erstellen, haben wir eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um den optimalen Impfplan zu ermitteln. Ein repräsentatives Schema ist in Abb. 1A dargestellt. H22-Hepatokarzinomzellen wurden zunächst Balb/c-Mäusen ip inokuliert, die Peritonealspülung wurde gesammelt und 105 Zellen aus der Spülung wurden sc in neue Empfänger injiziert. 5, 7 oder 10 Tage später wurden den inokulierten Mäusen 250 μg Al(OH)3 in 250 μl PBS oder PBS allein ip injiziert, gefolgt von der gleichen Behandlung alle drei oder vier Tage für insgesamt 6 Injektionen (Abb . 1A). In allen Alaun-Behandlungsplänen zeigten diejenigen, die 7 oder 10 Tage nach der Tumorinokulation begonnen wurden, einen Anstieg des Tumorvolumens ähnlich der PBS-Kontrolle. Interessanterweise zeigte die 5 Tage später begonnene Behandlung (Alaun 5DPI) eine deutliche Wachstumsreduktion, wobei die Unterschiede mit der Zeit größer wurden (Abb. 1B). Wir haben diesen Zeitplan dann für detailliertere Analysen ausgewählt. In Übereinstimmung mit dem ersten Befund waren die Tumoren, die 25 Tage nach der Inokulation aus den mit Alaun 5DPI behandelten Mäusen entfernt wurden, sichtbar kleiner als die PBS-Kontrolle (Abb. 1C, D). Dies ging mit einem statistisch signifikanten Überlebensvorteil einher, da am Tag 54 keine Mäuse in der PBS-Gruppe übrig blieben, im Gegensatz zu einer Überlebensrate von 50 % in der Alaun-5DPI-Gruppe (Abb. 1E). Obwohl sich das In-vivo-Wachstumspotenzial von H22 im Laufe der Zeit wahrscheinlich als Folge der Zellkultur veränderte, was zu leicht unterschiedlichen Wachstumsraten von Experiment zu Experiment führte, deutet dieses Ergebnis dennoch darauf hin, dass die Alauninjektion allein, verabreicht nach der Etablierung eines Hepatokarzinoms, im Vergleich zur PBS-Kontrolle dazu führt eine unerwartete Unterdrückung des Tumorwachstums.

Die alleinige Behandlung mit Alaun hemmt das Wachstum von H22-Tumoren.

Gruppen weiblicher Balb/c-Mäuse (sieben pro Gruppe) wurden am Tag 0 sc mit 105 H22-Tumorzellen pro Maus inokuliert. Tumortragenden Mäusen wurden zweimal 0,25 mg/250 μl Al(OH)3 oder 250 μl PBS ip injiziert wöchentlich für 3 aufeinanderfolgende Wochen. (A) Eine schematische Darstellung des Behandlungsprotokolls. (B) Liniendiagramm, das das Tumorvolumen bei Mäusen mit H22-Tumoren darstellt, die im Laufe der Zeit verschiedene Behandlungen erhalten. (C) Veränderungen des Tumorvolumens bei H22-tumortragenden Mäusen, die ab dem 5. Tag mit Al(OH)3 oder PBS behandelt wurden. (D) Fotos von Tumoren von getöteten Mäusen und isolierten soliden Tumoren am 22. Tag. (E) Kaplan-Meier-Überlebensanalyse jeder Gruppe. Jeder Wert stellt den Mittelwert ± SEM dar. *p < 0,05, **p < 0,01 und ****p < 0,0001. Nicht markierte Vergleiche sind statistisch nicht signifikant.

Um die immunologischen Veränderungen zu untersuchen, die mit der Tumorsuppression in Abb. 1 verbunden sind, haben wir das Zytokinprofil in der Peritonealspülung und im Tumorhomogenat über die Zeit verfolgt. Abbildung 2A zeigt, dass IL-1β und IL-6 in der Spülung der Alaun-5DPI-Mäuse im Vergleich zur PBS-Kontrolle leicht erhöht waren, obwohl die absoluten Mengen recht niedrig waren. Im Gegensatz dazu waren die Mengen an IL-1β und TNFα in den mit Alaun behandelten Gruppen erhöht (Abb. 2B), was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit einer verstärkten Entzündungsreaktion verbunden ist.

Verbesserte Immunaktivierung bei mit Alaun 5DPI behandelten tumortragenden Mäusen.

Balb/c-Mäuse wurden sc mit 105 H22-Zellen inokuliert und 5 Tage später zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt. Mäuse wurden wie angegeben mit Al(OH)3 behandelt. Peritoneale Waschflüssigkeit und interstitielle Tumorflüssigkeit wurden 3 Tage nach der 1., 3. und 6. Alauninjektion gesammelt. Die Spiegel von IL-1β, IL-6, TNF-α und IL-10 in Peritonea (A) und Tumor (B) wurden mittels ELISA analysiert. (C) Nacktmäuse wurden mit 105 H22-Zellen geimpft und mit Al(OH)3 oder PBS behandelt. Liniendiagramm, das das Tumorvolumen bei H22-tumortragenden Nacktmäusen darstellt, die eine Alaun- oder Kontrollbehandlung erhalten. (D) Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von H22-tumortragenden Nacktmäusen. Jeder Wert stellt den Mittelwert ± SEM dar. *p < 0,05, **p < 0,01. Nicht markierte Vergleiche sind statistisch nicht signifikant.

Alaun wurde räumlich und zeitlich entfernt von der H22-Tumorimpfung verabreicht. Standardmäßig kann das Vorhandensein partikulärer oder kristalliner Strukturen angeborene Immunantworten aktivieren, insbesondere als Folge der Interaktion mit Phagozyten. Von großem Interesse war, ob die Alaun-vermittelte Tumorsuppression auch die adaptive Immunität erforderte. Zu diesem Zweck führten wir das Experiment von Abb. 1 an nackten Balb/c-Mäusen durch. Abbildung 2C,D zeigt, dass der durch Alaun hervorgerufene Schutzvorteil bei fehlender zellulärer Immunität verloren ging, gemessen an der Tumorgröße oder Mortalität.

Die Kontrolle der neoplastischen Pathogenese durch die zelluläre Immunität ist äußerst komplex. Während CD8+ T-Zellen ihre Wirkung über Zytolyse und Apoptose-Induktion ausüben können, werden auch CD4+ T-Zellen zunehmend als wichtiger Faktor erkannt, der die Zytokinproduktion und die Tumormikroumgebung moduliert36, zusätzlich zu einer Untergruppe dieser Zellen, regulatorischen T-Zellen, die als a ausgleichender Faktor. Am Tag 6, 9, 13, 16, 20 und 23 nach der Inokulation infundierten wir Mäuse, die mit Alaun 5DPI behandelt wurden, blockierende Antikörper gegen CD8, CD4 und den Neutrophilenmarker Ly6G ip. Abbildung 3A zeigt, dass die Abreicherung von CD3+- oder CD8+-T-Zellen die Schutzwirkung im Wesentlichen beseitigte; während die Entfernung von CD4+-T-Zellen zu einer geringfügigen, statistisch nicht signifikanten Verringerung des Schutzes führte. Die Erschöpfung der Neutrophilen führte auch zu einer zwischenzeitlichen Aufhebung des Schutzes. Um die Rolle von CD8+ T-Zellen zu bestätigen, wurden Lymphozyten aus mit Alaun 5DPI behandelten Gruppen nach drei Injektionen geerntet und mit H22-Tumorlysat stimuliert. Die Expansion von CD8+ T-Zellen wurde durch FACS analysiert und der Teilungsindex (Verhältnis der Expansion in Gegenwart von Tumorlysat in Abwesenheit) wurde in Abb. 3B aufgetragen. Offensichtlich zeigten die CD8+-T-Lymphozyten in den mit Alaun behandelten Mäusen im Vergleich zur PBS-Kontrolle eine erhebliche Expansion. Während sich der Prozentsatz im Blut insgesamt nicht veränderte und bei LNs, die die Inokulationsstelle entleerten, sogar leicht abnahm, infiltrierte eine große Anzahl von CD8+ T-Zellen den Tumor in der Alaungruppe (Abb. 3C). Entsprechend der geringeren Beteiligung von CD4+-T-Zellen wurde an diesen Stellen keine Veränderung für CD4+-T-Zellen beobachtet (Abb. 3D). Daher zeigen mit Alaun behandelte Mäuse eine erhöhte H22-tumorspezifische CD8+-T-Zell-Immunität, während die CD4+-T-Zell-Reaktion nicht kritisch zu sein scheint. Wir konnten keine nennenswerten NK-Zellen im Tumor nachweisen (nahe oder unter 1 %). Andererseits traten Treg-Zellen am 15. Tag in der PBS-Kontrolle in größerer Zahl auf als in der mit Alaun behandelten Gruppe, was darauf hindeutet, dass Alaun den Anstieg von Treg-Zellen in der Tumorwachstumsumgebung unterdrücken könnte (ergänzende Abbildung 1).

CD8+ T-Zellen sind für die Alaun-induzierte Tumorsuppression unerlässlich.

(A) Balb/c-Mäuse wurden sc mit H22-Zellen geimpft und mit Al(OH)3 oder PBS behandelt. Tumortragenden Mäusen wurden 1 Tag nach jeder Al(OH)3-Injektion 100 μg Anti-Ly6G-, Anti-Maus-CD8- oder Ratten-IgG2a-κ-Isotyp-Kontrollantikörper in 200 μl PBS ip injiziert. Das Tumorvolumen wurde alle 3 Tage gemessen. (B) Drainierende LNs wurden 15 Tage nach der Tumorinokulation von tumortragenden Mäusen in mit PBS und Al(OH)3 behandelten Gruppen geerntet. Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt, mit dem Zellproliferationsfarbstoff eFluor 670 markiert und mit 10 μg/ml H22-Zelllyse (Protein) für 72 Stunden stimuliert und mittels FACS analysiert. Peripheres Blut, Milz, ableitende LNs und Tumor wurden 3 Tage nach der 1., 3. und 6. Injektion von tumortragenden Mäusen entnommen. Die prozentualen Anteile von CD8+ (C) und CD4+ (D) T-Zellen an den gesamten T-Zellen bzw. an den gesamten Zellen wurden mittels FACS analysiert. Die P-Werte für D15-CD8+- und CD4+-Zellen in entwässernden Lymphknoten und CD8+-Zellen im Tumor betragen 0,035, 0,045 bzw. 0,047.

Um global zu analysieren, wie sich die Alaunbehandlung auf den H22-Tumor auswirkt, wurde ein Genexpressionsprofil des chirurgisch geheilten Tumors 15 Tage nach der Inokulation mittels Microarray-Genchip-Analyse untersucht. Nach der Alaunbehandlung wurden 364 Gene unterschiedlich exprimiert (ergänzende Abbildung 2). Von diesen Genen waren 20 hochreguliert. Alle diese Gene können in vier Kategorien eingeteilt werden: 1. Unterdrückung der Tumorigenität, wie z. B. St14 (Suppression of Tumorigenicity 14)37; 2. Immunregulation, wie Wif1 (Wnt Inhibitory Factor 1)38; 3. Apoptose-Induktion und Proliferationshemmung, wie Dapk2 (Death-Associated Protein Kinase 2)39, Gas-1 (Growth Arrest Specific 1)40; 4. antimikrobielle Infektionen wie Ear2 (Eosinophil-Associated Ribonuclease 2), 10, 12 und 4B41,42 (Abb. 4A). Obwohl die unmittelbare Auswirkung dieser Genregulation bei mit Alaun behandelten Mäusen nicht klar war und Faktoren wie Chemokinveränderungen nicht nachgewiesen wurden (siehe unten), zeigte dieser Test dennoch ein anderes Profil, das auf eine Tumorsuppression bei diesen Mäusen hindeutet.

Veränderungen in der Genregulation und Chemokinproduktion nach Al(OH)3-Behandlung.

(A) Wärmekarten, die die hierarchische Gruppierung von Proben entlang von Genen in einer festen Reihenfolge für Tumorproben in mit PBS und Al(OH)3 behandelten Gruppen zeigen. Tumoren wurden 15 Tage nach der Inokulation tumortragenden Mäusen entnommen. Die Gesamt-RNA wurde wie in den Methoden beschrieben extrahiert und quantifiziert. Der Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde anhand von drei biologischen Replikaten durchgeführt. Gezeigt werden Transkripte, die als mit der Tumorsuppression in Zusammenhang stehend klassifiziert wurden und deren Expressionsniveaus sich zwischen zwei Gruppen deutlich unterscheiden. (B,C) Balb/c-Mäuse wurden mit 105 H22-Zellen geimpft, 5 Tage später wurden tumortragende Mäuse zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt. Peritoneale Waschflüssigkeit und interstitielle Tumorflüssigkeit wurden 3 Tage nach der 1., 3. und 6. Injektion von Mäusen gesammelt. CCL2, CXCL9 und CCL5 in Peritonea (B) und Tumorflüssigkeit (C) wurden mittels ELISA analysiert. Jeder Wert stellt den Mittelwert ± SEM dar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Nicht markierte Vergleiche sind statistisch nicht signifikant.

Wir gingen davon aus, dass die Infiltration von CD8+-T-Zellen in den Tumor das Ergebnis chemotaktischer Veränderungen war. Peritonealspülungen und Lysate des wiederhergestellten Tumors wurden auf CCL2-, CCL9- und CCL5-Spiegel überwacht. Abbildung 4B zeigt, dass alle diese Chemokine in größeren Mengen in der mit Alaun behandelten Gruppe vorhanden waren, zumindest am Tag 15 nach der Tumorimpfung. Interessanterweise wurde festgestellt, dass am 15. Tag nur CCL2 im Tumorlysat erhöht war, was mit der Fähigkeit dieses Chemokins übereinstimmt, CD8+ T-Zellen anzuziehen (Abb. 4C). Da dieser Anstieg relativ spät auftrat, deutete er auf eine verstärkte Monozyteninfiltration hin, die mit einer verstärkten CD8-Reaktion gegen Ende des Behandlungsplans einherging.

In Abb. 3A führte die Behandlung mit Ly6G-Antikörpern zu einer spürbaren Umkehrung der Antitumorwirkung von Alaun. Im Gegensatz zu Tumorantigen-spezifischen CD8+ T-Zellen ist die Assoziation von Neutrophilen und Tumor komplexer. Während allgemein angenommen wird, dass diese Zellen dazu beitragen, eine wachstumsfördernde Mikroumgebung zu schaffen und so den Tumor zu fördern, deuten neuere Studien darauf hin, dass sie in einigen Fällen auch Tumorzellen abtöten43,44,45. In der mit Alaun behandelten Gruppe gab es kaum Veränderungen bei der Gesamtzahl der Neutrophilen im Blut, sie waren jedoch im Tumor erhöht, was darauf hindeutet, dass Alaun eine entzündungsfördernde Umgebung fördert (Abb. 5A). Um herauszufinden, ob die rekrutierten Zellen den Tumorzelltod effizienter auslösen konnten, wurden aus dem Blut gewonnene Neutrophile in einem Co-Kulturtest mit H22-Zellen verwendet. Offensichtlich waren Neutrophile der mit Alaun behandelten Mäuse bei der Vermittlung des Annexin-V-Umsatzes auf den Zielzellen viel effizienter als solche aus der PBS-Gruppe (Abb. 5B), was im Einklang mit der verringerten Tumorsuppression steht, wenn Ly6G-Antikörper zur Dezimierung dieser Population verwendet wurde .

Neutrophile im Tumor.

(A) Mäusen mit etablierten Tumoren wurde ip Al(OH)3 oder PBS injiziert. Peripheres Blut, Milz, ableitende LNs und Tumor wurden von tumortragenden Mäusen am Tag 3 nach der 1., 3. und 6. Injektion entnommen. Der Prozentsatz der Neutrophilen in von Myeloiden abgeleiteten Zellen oder in den gesamten Zellen der Milz, der LNs und des Tumors wurde durch FACS erfasst. (B) Neutrophile wurden aus tumortragenden Mäusen in verschiedenen Gruppen gereinigt und mit eFluor 450-markierten H22-Zellen im Verhältnis 20:1 kokultiviert. 12 Stunden später wurden die Tumorzellen abgeschirmt und ihre Apoptose ausgewertet (rechtes Diagramm). (C) Die Prozentsätze der abgetöteten Tumorzellen wurden berechnet. Jeder Wert stellt den Mittelwert ± SEM dar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Nicht markierte Vergleiche sind statistisch nicht signifikant.

In Abwesenheit eines gleichzeitig verabreichten Antigens übt Alaun vermutlich seine Antitumorwirkung aus, indem es die Antigenpräsentation unspezifisch hochreguliert, um antigenspezifische T-Zellen zu aktivieren. Ohne die gezielte Bekämpfung spezifischer Antigene ist es möglich, dass Immunantworten gegen eine Vielzahl von Epitopen induziert werden, die von Tumorantigenen abgeleitet sind, einschließlich solcher, die normalerweise auf regulären Wirtszellen vorhanden sind. Dies könnte zu einer Autoimmunität führen. Da andererseits in unserem Protokoll Alaun wiederholt verabreicht wurde, könnte seine Fähigkeit, eine angeborene Immunität hervorzurufen, zu unbeabsichtigten Gewebeschäden führen. Frühere Zahlen zeigen, dass sich die Gesamtzahl der Immunzellen oder Zytokinspiegel im Blut und in der Milz nicht drastisch verändert hat, was auf das Fehlen einer systemischen Schädigung schließen lässt. Milz-, Nieren- und Lungenschnitte wurden nach der gesamten Behandlung mit Alaun 5DPI angefertigt. Die H&E-Färbung zeigte keinen groben Unterschied zwischen Proben von PBS- und Alaun-behandelten Mäusen (Abb. 6A–C), was bestätigt, dass eine wiederholte Alaunbehandlung wahrscheinlich ein sicheres Protokoll ist.

Fehlen allgemeiner Schäden bei Mäusen, die mit Alaun behandelt wurden.

Mäusen mit etablierten Tumoren wurde Al(OH)3 und PBS ip injiziert. Milz, Leber und Niere wurden den Mäusen 3 Tage nach der letzten Behandlung entnommen, geschnitten und durch H&E-Färbung (Vergrößerung × 100) bewertet. (A) Milz von mit PBS oder Alaun behandelten Mäusen; (B) Leber aus zwei Gruppen; (C) Niere aus zwei Gruppen.

Alaun wurde erstmals in den 1920er Jahren von Glenny beim Menschen eingesetzt46 und 1952 von Salk auf die bevölkerungsbezogene Polioimpfung ausgeweitet47. Alaun war das am weitesten verbreitete Adjuvans. Die detaillierte Zusammensetzung von Alaun, im weitesten Sinne als dreiwertiges Aluminiumsalz definiert, hat sich im Laufe der Zeit verändert, vom ursprünglichen Rohaluminiumkali hin zum heute vorherrschenden Al(OH)3 und AlPO4. Alaun hat sich als sicher erwiesen und löst wirksam Antikörperreaktionen aus, insbesondere IgG1 und IgE48. Sein Hauptdefizit bleibt jedoch die Unfähigkeit, TH1/CTL-Reaktionen auszulösen49. Aufgrund des dringenden Bedarfs an der Entwicklung von Impfstoffen zur Bekämpfung von Tumor- und Virusinfektionen wurden große Anstrengungen unternommen, um seine Fähigkeit zur Induktion von Kreuzpräsentation und Aktivierung von CD8-T-Zellen zu verbessern. Beispielsweise wurde Alaun mit einem LPS-Derivat Lipid A gemischt, um die Reaktion gegen Malaria zu verstärken50. Saponin-basiertes QS21 hat auch gezeigt, dass es die Aktivierung von CD8-T-Zellen induzieren kann51. Während die meisten TH1/CD8-Adjuvantien für den menschlichen Gebrauch zu toxisch sind, befinden sich diejenigen, die für eine bevölkerungsbasierte Immunisierung geeignet sind, noch in der Entwicklung oder werden nur begrenzt eingesetzt. Dieser Bericht stellt daher eine überraschende Erkenntnis dar, dass die Injektion von Alaun mit einem sorgfältig entwickelten Protokoll eine Antitumor-CTL-Reaktion auslösen kann. Es ist wichtig zu beachten, dass Alaun, ein Adjuvans, das seit fast einem Jahrhundert sicher verwendet wird, unspezifische Tumorsuppressionseffekte zeigt, indem es eine CD8-T-Zellantwort auslöst. Obwohl die Reaktion im Vergleich zu anderen Protokollen mild ausfiel und äußerst präzises Timing erfordert, sind ihre Auswirkungen auf die zukünftige Entwicklung einer Adjuvans-alleinigen Tumortherapie faszinierend.

Trotz seiner langen Geschichte ist der Mechanismus der Adjuvanswirkung von Alaun immer noch umstritten. In frühen Jahren wurde Alaun zur Ausfällung mikrobieller Antigene (Toxoid) verwendet. Daher wurde angenommen, dass es als Depot gegen Diffusion fungierte52. Bei Mäusen, denen Fibrinogen fehlt, das für die Bildung von Knotenstrukturen an der Injektionsstelle von Alaun unerlässlich ist, ändert sich die Wirksamkeit von Alaun jedoch nicht53. Darüber hinaus hat die chirurgische Entfernung der Injektionsstelle Stunden nach der Impfung keinen Einfluss auf die Adjuvanswirkung54. Die Depottheorie wurde daher verworfen. Im letzten Jahrzehnt wurde festgestellt, dass Alaun Phagozyten (Makrophagen und DCs) durch Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms zur Sekretion von IL-1β anregt55,56. Darauf folgte ein Bericht, der darauf hinwies, dass NLRP3 für die adjuvante Wirkung von Alaun von entscheidender Bedeutung sei57. Diese Annahme wurde durch mehrere Folgeberichte in Frage gestellt, in denen festgestellt wurde, dass ein NLRP3/Caspase-1-Mangel die Alaun-induzierte Antikörperproduktion nicht verringert24,58,59,60,61,62,63. Kürzlich haben wir berichtet, dass Alaunkristalle in der Lage waren, DC-Plasmamembran-Lipidspezies zu sortieren, hauptsächlich aufgrund ihrer starken Bindung an Sphingomyelin. Diese Lipidumlagerung induzierte eine Syk-abhängige PI3K-Signalübertragung, die zur DC-Aktivierung führte64. Kristalline Strukturen im Gewebe führen häufig zum Zelltod und zur Freisetzung intrazellulärer Inhalte. Zwei Berichte deuten darauf hin, dass die DNA-Freisetzung aus toten Zellen von DCs eingefangen werden könnte und diese Zellen in MHC II/TLR9-abhängiger Weise aktivieren24,65. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Alaun auch die DC-Sekretion von PGE226,66 auslöst, einem bekannten DC-aktivierenden Faktor67,68. Dies ist interessant, da sowohl PI3K als auch PGE2 Inhibitoren der Antigenpräsentation sind66,69. Unsere Feststellung, dass Alaun die Aktivierung von CD8+-T-Zellen auslösen kann, scheint mit diesen Berichten nicht übereinzustimmen. Allerdings produzieren mit Alaun behandelte Mäuse auch Harnsäure61,70, der resultierende MSU-Kristall ist ein starker Aktivator der Kreuzpräsentation71,72. Germains Gruppe berichtete vor fast 20 Jahren, dass das Vorhandensein eines phagozytischen Ziels auf der Oberfläche von Makrophagen die externen Antigene in den Kreuzpräsentationsweg trieb73,74. Wir haben kürzlich einen möglichen Mechanismus vorgeschlagen, der für diese umgeleitete Antigenpräsentation verantwortlich ist: Die Bindung phagozytischer Ziele verlangsamt die endozytische Reifung in DCs. Die externen Antigene, die über diesen Weg in die Zelle gelangen, werden in ihrer Verarbeitung zur MHC-Klasse-II-Antigenpräsentation verzögert. Stattdessen werden die Antigene im Komplex mit MHC-Klasse-I-Molekülen über den endozytischen Recyclingweg zur Zelloberfläche umgeleitet75.

Das Überraschende an dieser Arbeit ist das Fehlen einer Tumorsuppression bei anderen Alaun-Injektionsschemata als 5DPI. In unseren früheren klinischen Studien am Menschen und in Mausmodellen haben wir berichtet, dass mehrere Injektionen von Alaun erforderlich waren, um eine Schutzwirkung gegen HBV-HBeAg bzw. Entzündungsreaktionen auszulösen76,77. Das Fehlen einer Wirkung in den anderen Zeitplänen könnte daher darauf zurückzuführen sein, dass Alaun 5DPI ein für die Immunüberwachung durchdringbares Fenster in der Tumorbildung einnahm, das zu späteren Zeitpunkten verschwinden würde. Es bleibt unklar, wie genau die ip-Injektion von Alaun zu einer besseren Antigenpräsentation und der Rekrutierung von CD8+-T-Zellen/Neutrophilen im Tumor führte. Es ist möglich, dass an einer distalen Stelle injiziertes Alaun eine bessere entzündliche DC-Umwandlung aus zirkulierenden Monozyten78,79 fördert, die später möglicherweise zur Inokulationsstelle wandern. Darüber hinaus handelt es sich bei Alaun um eine amorphe Ansammlung von Kristallen, deren Größe teilweise im Nanometerbereich liegt und über weite Strecken zu anderen Stellen im Körper wandern kann80. Beim Eintreffen dieser DCs oder Kristalle im Tumor kann ein Milieu aufgebaut werden, das die Antigenpräsentation begünstigt, insbesondere mit Hilfe gleichzeitig induzierter proinflammatorischer Zytokine81. Die Klärung dieser Details bedarf jedoch weiterer Analysen.

Spezifisches DC-Targeting bei der Antitumorimpfung hat einen Vorteil hinsichtlich der Wirksamkeit. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, dass bei einer vollständigen tumorspezifischen Immunantwort eine starke CD8+-T-Zellaktivierung mehr als nur DCs erfordert. Auch andere Zelltypen wie CD4+ T, NK und Neutrophile sind am Endergebnis beteiligt82. Darüber hinaus bestehen DCs aus mehreren Subtypen, und eine bestimmte DC-Targeting-Methode erreicht wahrscheinlich nicht einige Populationen, die möglicherweise für Tumorimmunreaktionen wichtig sind83,84. Die alleinige Injektion von Alaun in tumortragende Mäuse ist eine passive und ergebnisorientierte Strategie, die die vollständige Bewertung verschiedener Zelltypen und Aktivierungswege umgeht. Aufgrund ihrer bewährten Sicherheit könnte diese vereinfachte Tumorimmuntherapie zu zusätzlichen alleinigen adjuvanten Behandlungen führen, um deren mögliche Anwendung bei menschlichen Patienten zu prüfen.

Weibliche Balb/c-Mäuse wurden von Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. LTD gekauft. Weibliche Nacktmäuse (5 bis 6 Wochen alt) wurden vom Shanghai Institute of Materia Medica (Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China) erhalten. Alle Mäuse wurden an der Fudan-Universität unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten und gemäß den Tierschutzrichtlinien der Fudan-Universität behandelt. Maus-Hepatom-H22-Zellen wurden freundlicherweise von Hengrui Zhang (Peking University Hepatology Institute, Peking, China) gespendet. H22-Zellen wurden in Komplettmedium bestehend aus RPMI1640, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10 % fötalem Rinderserum (FBS) kultiviert.

Alle experimentellen Methoden mit Mäusen wurden vom Animal Protocol Committee der Fudan-Universität genehmigt und gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt.

Fluoreszenzmarkierte monoklonale Ratten-Anti-Maus-Antikörper: Anti-CD3e-FITC (145-2C11), Anti-CD4-FITC (GK1.5), Anti-CD4-APC (GK1.5), Anti-CD8α-PE (53). -6,7), Anti-CD11b-FITC (M1/70), Isotypkontrollen, gereinigte monoklonale Antikörper in funktioneller Qualität zur Depletion von Neutrophilen, CD3+, CD4+, CD8+ T-Zellen, einschließlich Anti-Maus-Ly6G (Gr-1) (Rb86-C5) , Ratten-IgG2b-κ-Isotypkontrolle (eB149/10H5), Anti-Maus-CD3e (145-2C11), Anti-Maus-CD4 (GK1.5), Anti-Maus-CD8 (53-6.7), Zellproliferationsfarbstoff eFluor 670 und Zellproliferation Der Farbstoff eFluor 450 wurde von eBioscience bezogen. Anti-Maus-Ly6G-Pacific Blue (1A8) wurde von Biolegend gekauft.

H22-Zellen wurden in die Bauchhöhle einer Balb/c-Maus übertragen. 7 Tage später wurde der Aszites geerntet und mit PBS auf eine Konzentration von 106 Zellen/ml verdünnt. Insgesamt 105 H22-Zellen in 0,1 ml wurden sc in die rechte Flanke von Balb/c-Mäusen injiziert. Nach 5 Tagen wurden die tumortragenden Mäuse nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen (5 pro Gruppe) eingeteilt, um die Tumorbildung zu ermöglichen: Gruppe 1 wurde ab dem 5. Tag ip mit PBS injiziert; Gruppe 2 mit Al(OH)3 am selben Tag; Gruppe 3 mit Al(OH)3 ab dem 7. Tag; und Gruppe 4 mit Al(OH)3 ab dem 10. Tag. Zur Alauninjektion wurde Balb/c-Mäusen (7 pro Gruppe) bis zu 3 Wochen lang zweimal pro Woche Al(OH)3 (National Vaccine & Serum Institute, Peking, China) in einer Dosis von 0,25 mg ip injiziert. Die angegebenen Dosen wurden mit PBS-Lösung auf 1 mg/ml (250 μl) verdünnt. Das Tumorwachstum wurde alle 3 Tage mit einem Messschieber gemessen und die Größe als größter Längsdurchmesser (Länge) und größter Querdurchmesser (Breite) aufgezeichnet. Das Tumorvolumen wurde nach folgender Gleichung berechnet: Volumen = 0,52 × Länge × Breite2. Die Mäuse wurden getötet, als der Tumor eine Länge von 20 mm erreichte. Zur Tumorimpfung bei Nacktmäusen wurden 105 H22-Zellen pro Maus sc inokuliert (7 pro Gruppe). Fünf Tage später wurden die Mäuse in zwei Gruppen aufgeteilt, die wie zuvor beschrieben Al(OH)3 und PBS erhielten.

Peritoneale Waschflüssigkeit und interstitielle Tumorflüssigkeit wurden 3 Tage nach der 1., 3. und 6. Injektion von Al(OH)3 oder PBS von Mäusen gesammelt. Zur Peritonealwäsche wurde den Mäusen 1 ml PBS ip injiziert und die Flüssigkeit wurde gesammelt. Zur Gewinnung interstitieller Tumorflüssigkeit wurden Flankentumoren von Balb/c-Mäusen entnommen, zerkleinert und mit 1 ml RPMI 1640-Medium resuspendiert. Zelltrümmer wurden abzentrifugiert und die Flüssigkeiten durch einen 0,2-um-Spritzenfilter geleitet. Alle Proben wurden mit dem Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit (Milliplex, Darmstadt, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf IL-1β, IL-10, TNFα, IL-6, CCL2, CXCL9 und CCL5 untersucht.

Kurz gesagt, Balb/c-Mäusen wurden 100 μg funktioneller gereinigter Anti-Ly6G-, Anti-Maus-CD3-, Anti-Maus-CD4-, Anti-Maus-CD8- oder Ratten-IgG2b-κ-Isotyp-Antikörper in 200 μl PBS ip injiziert. Während des gesamten Versuchszeitraums wurde zweimal pro Woche eine Erhaltungsdosis von 100 μg Antikörper ip injiziert, um die Erschöpfung sicherzustellen.

5 Mäuse aus jeder Tumor-inokulierten Gruppe wurden 3 Tage nach der 1., 3. und 6. Injektion getötet. Milzen und Flankentumoren wurden entnommen. Tumorgewebe wurde zerkleinert und mit 4 mg/ml Kollagenase Typ IV und 2 mg/ml DNase I (beide von Sigma) bei 37 °C 30 Minuten lang verdaut. 5 × 105 Zellen wurden zu jeder Vertiefung in 96-Well-Kulturplatten mit flachem Boden in einem Volumen von 100 μl gegeben. FITC-konjugiertes Ratten-Anti-Maus-CD11b und Pacific Blue-konjugiertes Ratten-Anti-Maus-Ly-6G wurden zur Färbung von Neutrophilen verwendet; FITC-, PE- und APC-markierte Anti-Maus-CD3e, CD8, CD4 wurden zur Färbung von CD4+/CD8+-T-Zellen verwendet. Die gesamte Durchflusszytometrie wurde am LSR Fortessa (BD) durchgeführt. Die Datenanalyse wurde mit der FlowJo-Software durchgeführt.

Drainierende LNs wurden von tumortragenden Mäusen gewonnen. Es wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt. Der Zellproliferationsfarbstoff eFluor 670 wurde in DMSO als 5 mM Stammlösungen gelöst. Für die eFluor 670-Markierung wurden die Lymphozyten in PBS auf 107 Zellen/ml resuspendiert und 5 μM eFluor 670 zu 1 ml-Aliquots der Lymphozyten hinzugefügt. Die Zellen wurden 10 Minuten bei 20 °C und dann 5 Minuten auf Eis inkubiert und dreimal mit Kulturmedium gewaschen. Für das H22-Zelllysat wurden 3 × 108 H22-Zellen gesammelt und in 2 ml PBS resuspendiert. Um Zelllysat zu erhalten, wurden drei Einfrier-Auftau-Zyklen durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen 3 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Die Proteinkonzentration im Überstand wurde mittels Bradford-Assay (Bio-Rad) gemessen und mit PBS auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml verdünnt. 3 × 105 eFluor 670-markierte Lymphozyten wurden zu jeder Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 100 μl gegeben und mit H22-Zelllysat (10 μg/ml) bei 37 °C in 5 % CO2 stimuliert. Als Positivkontrolle wurden Anti-CD3 (1 μg/ml) und Anti-CD28 (0,5 μg/ml) verwendet. Nach 72-stündiger Stimulation wurden die Lymphozyten durch Anfärben der Zelloberfläche mit PE-markiertem Anti-Maus-CD8-mAb und FITC-markiertem Anti-Maus-CD4-mAb gemessen und die gefärbten Zellen mittels FACS analysiert. Die Daten wurden als Stimulationsindex (SI) ausgedrückt und nach der folgenden Formel berechnet: SI = eFluor 670-Tumorzelllyse stimuliert / eFluor 670 unstimuliert.

Tumortragende Mäuse wurden getötet und Milz, Leber und Niere zu den angegebenen Zeitpunkten herausgeschnitten. Das Gewebe wurde in 4%ige Formalinlösung gelegt. Das fixierte Gewebe wurde der Länge nach halbiert und in Parafilm eingebettet. Es wurden 4 bis 5 μm große Schnitte angefertigt und dann mit H&E gefärbt. Mittels Lichtmikroskopie wurde der Status der Nekrose und Kondensation des Zellkerns ermittelt.

Flankentumoren wurden 3 Tage nach der 3. Injektion gesammelt. Das Gesamt-RNA- und miRNA-Anreicherungsverfahren wurde mit dem AM1561 mirVana miRNA Isolation Kit ohne Phenol (Ambion) durchgeführt. Die Gesamt-RNA wurde mit dem NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific) quantifiziert und die RNA-Integrität mit dem Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) bewertet. Die Probenmarkierung, Microarray-Hybridisierung und das Waschen wurden basierend auf den Standardprotokollen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, Gesamt-RNA wurde in doppelsträngige cDNA transkribiert, dann zu cRNA synthetisiert und mit Cyanin-3-CTP markiert. Die markierte cRNA wurde auf dem Microarray hybridisiert (Agilent Mouse Gene Expression 8*60 K, Design ID: 028005). Nach dem Waschen wurden die Arrays mit dem Agilent Scanner G2505C gescannt. Mit der Feature-Extraction-Software (Version 10.7.1.1, Agilent Technologies) wurden Array-Bilder analysiert, um Rohdaten zu erhalten. Genespring wurde eingesetzt, um eine grundlegende Analyse mit den Rohdaten durchzuführen. Kurz gesagt, die Rohdaten wurden mit dem Quantilalgorithmus normalisiert. Für die weitere Datenanalyse wurden die Sonden ausgewählt, die unter allen Bedingungen mindestens 100 % der Werte aufweisen und über die Markierung „Erkannt“ verfügen. Differenziell exprimierte Gene wurden dann durch Fold Change identifiziert und der P-Wert wurde mit dem T-Test berechnet. Der festgelegte Schwellenwert für hoch- und herunterregulierte Gene war eine fache Änderung ≥2,0 und ein P-Wert ≤0,05. Schließlich wurde hierarchisches Clustering durchgeführt, um das Expressionsmuster der unterscheidbaren Gene in den Proben anzuzeigen.

Vollblut wurde durch Herzpunktion mit einer heparinisierten Spritze entnommen. Das Blut wurde mit PBS (1:1) verdünnt und einem diskontinuierlichen Histopaque-Gradienten (Sigma, St. Louis, MO, USA) (1,077 und 1,119) unterzogen. Neutrophile wurden an der Grenzfläche 1.077–1.119 gesammelt, Lymphozyten und Monozyten an der Grenzfläche Plasma-1.077. Erythrozyten wurden durch hypotone Lyse eliminiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit RPMI 1640-Medium in einer Endkonzentration von 106 Zellen/ml resuspendiert. Die Reinheit der Neutrophilen wurde durch FACS bestimmt (>90 %).

H22-Zellen wurden mit dem Zellproliferationsfarbstoff eFluor 450 markiert. Die markierten Zellen (5000/Well) wurden auf einem 96-Well-Medium in RPMI 1640 mit 10 % FBS ausplattiert. Vier Stunden später wurden gereinigte Neutrophile (10 5/Vertiefung) zu den ausplattierten Tumorzellen gegeben und über Nacht kokultiviert. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen zum Nachweis der Apoptose von Tumorzellen (eFluor 450+-Zellen) geerntet. Die Apoptose wurde mit dem Annexin V-FITC-Apoptose-Nachweiskit (eBioscience) aufgezeichnet.

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism Software 6.0 durchgeführt und als Mittelwert ± SEM dargestellt. Für die gesamte Datenanalyse wurde eine ungepaarte Student-t-Testanalyse verwendet. P < 0,05 zeigt statistische Signifikanz an.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Science and Technology Projects of Major Infectious Diseases of China (2008ZX10002-003, 2012ZX10002002004 und 2012ZX10002002) und National High Technology 863 Projects (2012AA02A407) unterstützt. Wir möchten Frau Xu Jing vom National Vaccine & Serum Institute, Peking, China, für die Bereitstellung von Al(OH)3 für diese Studie und Xiaofei Wang von der Tsinghua-Universität für die Präsentation der Genchip-Daten danken

Schlüssellabor für molekulare medizinische Virologie, MOE/MOH, Shanghai Medical College, Fudan-Universität, Shanghai, China

Bo Wang, Xuanyi Wang, Yumei Wen, Zhangmei Ma und Bin Wang

Institut für Biomedizinische Wissenschaften, Fudan-Universität, Shanghai, China

Xuanyi Wang

International Cooperation Laboratory on Signal Transduction, Eastern Hepatobiliary Surgery Institute/Hospital und National Center for Liver Cancer, Shanghai, China

Jing Fu und Hongyang Wang

Institut für Immunologie, Abteilung für medizinische Grundlagenwissenschaften, Zentrum für Biowissenschaften, Tsinghua-Universität, Peking, China

Yan Shi

Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Infektionskrankheiten, Universität Calgary, Calgary, Kanada

Yan Shi

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BW, XW und JF führten alle Experimente durch. BW führte die Datenanalyse und Zahlenaufbereitung durch. YW, HW, ZM, YS und BW haben Experimente entworfen. YW, YS und BW konzipierten das Forschungsprojekt. BW und YS haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wang, B., Wang, X., Wen, Y. et al. Unterdrückung eines etablierten Hepatokarzinoms in einer rein adjuvanten Immuntherapie: Alaun löst eine Antitumor-CD8+-T-Zellantwort aus. Sci Rep 5, 17695 (2015). https://doi.org/10.1038/srep17695

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Eingegangen: 23. Juli 2015

Angenommen: 4. November 2015

Veröffentlicht: 09. Dezember 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep17695

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