Sofortige Synthese und vollständige Charakterisierung organischer Stoffe

Jul 31, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 9297 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Für die sofortige Herstellung von Laccase@Co3(PO4)2•Hybrid-Nanoblumen (HNFs) wurde ein neuartiger Ansatz namens „konzentrierte Methode“ entwickelt. Die konstruierten HNFs wurden durch Optimierung der Konzentration von Kobaltchlorid und Phosphatpuffer erhalten, um die höchste Aktivitätsrückgewinnung zu erreichen. Der Einbau von 30 mM CoCl2 und 160 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) führte zu einem schnellen anisotropen Wachstum der Nanomaterialien. Die vorgesehene Methode beinhaltete keine harten Bedingungen und eine längere Inkubation der Vorläufer, wie dies bei den am häufigsten beschriebenen Ansätzen für die Synthese von HNFs der Fall war. Die katalytische Effizienz der immobilisierten und freien Laccase betrug 460 bzw. 400 M−1S−1. Außerdem betrug die enzymatische Aktivität des hergestellten Biokatalysators 113 % des freien Enzyms (0,5 U mL−1). Die Stabilität der synthetisierten HNFs wurde bei pH 6,5–9,5 und den erhöhten Temperaturen um 400 % erhöht. Die Aktivität von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs sank nach 10 Wiederverwendbarkeitszyklen auf 50 % des ursprünglichen Wertes, was auf eine erfolgreiche Immobilisierung des Enzyms hinweist. Strukturstudien ergaben einen Anstieg des α-Helix-Gehalts um 32 % nach der Hybridisierung mit Kobaltphosphat, was die Aktivität und Stabilität der immobilisierten Laccase verbesserte. Darüber hinaus zeigten die hergestellten HNFs eine beträchtliche Fähigkeit, Moxifloxacin als neu auftretenden Schadstoff zu entfernen. Das Antibiotikum (10 mg L−1) wurde nach 24 Stunden zu 24 % bzw. 75 % durch Adsorption bzw. biologischen Abbau entfernt. Diese Studie stellt eine neue Methode zur Synthese von HNFs vor, die zur Herstellung effizienter Biokatalysatoren, Biosensoren und Adsorbentien für industrielle, biomedizinische und Umweltanwendungen verwendet werden könnte.

Das Vorhandensein von Mikroschadstoffen wie Arzneimitteln, Körperpflegeprodukten (PCPs), phenolischen und östrogenen Verbindungen in Abwässern gibt zunehmend Anlass zur Sorge1,2. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden verschiedene heterogene Biokatalysatoren für Umwelt- und Industrieanwendungen entwickelt3. Zur Entfernung von Mikroverunreinigungen wurde eine breite Palette von Enzymen wie Laccase, Manganperoxidase und Meerrettichperoxidase eingesetzt. Obwohl die Aktivität von Enzymen bei der Immobilisierung abnehmen kann, sind die immobilisierten Enzyme wiederverwendbar und stabiler gegenüber Betriebsbedingungen4. In diesem Zusammenhang wurden Enzymimmobilisierungstechnologien auf verschiedenen organischen und anorganischen Trägern wie elektrogesponnenen Fasern, magnetischen Nanopartikeln, Membranen, natürlichen Polymeren usw. entwickelt.5,6,7.

Moxifloxacin ist als Fluorchinolon (FQ) der vierten Generation für mehr als 34,6 % des gesamten FQ-Verbrauchs in China verantwortlich8. Es wird hauptsächlich zur Behandlung von Lungenentzündungen und Hautinfektionen eingesetzt. Aufgrund der Anwendung bei schwerem akutem respiratorischem Syndrom Coronavirus 2 ist der Moxifloxacin-Verbrauch in letzter Zeit vorübergehend gestiegen. Daher können der Verzehr, die Freisetzung und die Anreicherung von Moxifloxacin in der Umwelt bedrohlich sein8. Moxifloxacin ist außerdem das giftigste FQ gegen das Wachstum von Pseudokirchneriella subcaptitata9. Ebenso zeigte es erhebliche negative Auswirkungen auf das Wachstum und die Fortpflanzung von Ceriodaphnia dubia und Daphnia manga10. Daher kann ein erhöhter Verbrauch und eine erhöhte Freisetzung von Moxifloxacin in der Umwelt eine Gefahr für das Ökosystem und die menschliche Gesundheit darstellen. Die Effizienz aktueller Ansätze zur Eliminierung von Antibiotika aus Abwässern ist begrenzt11. In diesem Zusammenhang wurden bisher verschiedene Techniken zur Entfernung von Antibiotika etabliert, wie z. B. Biokatalyse12, Photokatalyse13, Elektrokatalyse14 usw. Laccasen, ein Oxidoreduktase-Enzym, werden in großem Umfang für Umwelt- und Industrieanwendungen eingesetzt15,16. Freie und immobilisierte Laccasen wurden zur biologischen Entfernung einer Vielzahl von Schadstoffen wie Bisphenol A, Kristallviolett, Säureorange-7, Levofloxacin usw. eingesetzt.17,18,19,20. Allerdings wurde bisher nicht über die Entfernung von Moxifloxacin durch Enzyme (frei oder immobilisiert) berichtet.

Die Herstellung neuer Plattformen auf Basis organisch-anorganischer Hybridmaterialien zur Immobilisierung von Enzymen ist von großem Interesse. Organisch-anorganische Hybrid-Nanoblumen (HNFs) sind blütenförmige hierarchische Nanostrukturen, die erstmals im Jahr 2012 entdeckt wurden21. HNFs bestehen aus Enzym(en) und anorganischen Komponenten, haben eine große Oberfläche, ein einfaches Syntheseverfahren und hierarchische poröse Strukturen22 . Es wurde berichtet, dass die Koordination zwischen dem Stickstoffatom der organischen Komponente und dem Metallion des anorganischen Teils für die Bildung von HNFs21 verantwortlich ist. Aufgrund ihrer interessanten Eigenschaften werden HNFs in großem Umfang in der Biokatalyse, Biosensorik und Biomedizin eingesetzt23. Auf HNFs basierende Biosensoren bieten eine niedrigere Nachweisgrenze (LOD) und schnellere Reaktionszeiten aufgrund der Adsorption und Konzentration von Verunreinigungen rund um Enzyme24. Biokatalysatoren auf HNF-Basis wurden zur Entfernung organischer Verunreinigungen wie Phenolverbindungen und Industriefarbstoffen eingesetzt23. Aufgrund der pH-abhängigen Freisetzung des immobilisierten Biomoleküls wurden HNFs auch als Plattform für die Arzneimittelabgabe integriert25. Es wurde berichtet, dass nach dem Einbau von Enzymen in HNFs deren Aktivität, Stabilität und Wiederverwendbarkeit deutlich zugenommen haben, was auf geringe Stofftransferbeschränkungen aufgrund ihres hohen Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnisses und kooperative Effekte zwischen Enzymen und Metallionen zurückzuführen ist26. Beispielsweise führte der Einbau von Lipase in Zn3(PO4)2·HNFs zu einer Steigerung der Enzymaktivität um 147 %. Außerdem war die Lagerstabilität der Lipase-haltigen HNFs dreimal höher als die der freien Lipase27. Carboanhydrase (CA) wurde erfolgreich in Ca8H2(PO4)6·HNFs immobilisiert und zeigte eine bemerkenswerte Stabilität gegenüber erhöhten Temperaturen (30–80 °C). CA@Ca8H2(PO4)6·HNFs behielten nach 5 Wiederverwendbarkeitszyklen 100 % ihrer ursprünglichen CO2-Hydratationsaktivität28. Die Zugabe von Kupfersulfat zu Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) in Gegenwart von Rinderserumalbumin (BSA) führte zur Synthese der blütenförmigen BSA@Cu3(PO4)2·HNFs21. Für die Herstellung von HNFs wurden drei Ansätze beschrieben, darunter einstufige Fällung21, ultraschnelle Ultraschallbehandlung29 und scherspannungsvermittelte Synthese30. Bei der einstufigen Fällungsmethode, einer einfachen und unkomplizierten Strategie, erfordert die Herstellung von HNFs eine lange Inkubationszeit (1–3 Tage). Da ein langer Synthesevorgang möglicherweise die Stabilität des organischen Bestandteils verringern kann, wurden ernsthafte Versuche unternommen, die Aufbauzeit zu verkürzen. Bei dieser Methode wurde die Synthesemischung, die Cu2+, Phosphationen und BSA enthielt, 5 Minuten lang in einem Ultraschallbad (40 kHz, 70 W) beschallt, was zur Bildung von ausgeblühten BSA@Cu3(PO4)2·HNFs29 führte. Kürzlich wurde berichtet, dass die organische Komponente und die anorganischen Vorläufer einer Scherbeanspruchung ausgesetzt werden, um HNFs auf Kupferbasis zu synthetisieren30,31. Die Mischung aus Kupfersulfat, BSA und PBS wurde in ein Vortex-Fluidgerät (VFD) gegeben und kräftig mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 9000 U/min und einem Neigungswinkel von 45° gedreht. Nach 2 Minuten erschienen toroidale Strukturen mit einem zentralen Hohlraum, die die endgültige sphärische HNF-Morphologie bildeten31.

Angesichts der Tatsache, dass sich HNFs in einem frühen Entwicklungsstadium befinden, ist der Entstehungsmechanismus von HNFs noch nicht genau geklärt. Es wird jedoch angenommen, dass die Bildung primärer Keimbildungsstellen von Metallphosphat(en) und organischen Molekülen (z. B. Protein, DNA usw.) und das zeitabhängige anisotrope Wachstum dieser primären Keimbildungsstellen32 für die Bildung verantwortlich sind der blütenartigen Strukturen. Es scheint, dass durch die Einführung kinetischer Energie in die Vorläufer, die durch Ultraschall und Vortexen bereitgestellt wird, die Zeit für den Zusammenbau der HNFs verkürzt wurde. Als effiziente Biokatalysatoren werden HNFs zur Entfernung neu auftretender Verunreinigungen wie Industriefarbstoffen eingesetzt. Allerdings wurde bisher nicht über die Fähigkeit von HNFs zur Entfernung von Antibiotika berichtet26.

Ziel der vorliegenden Studie war die Entwicklung einer neuartigen und schnellen Methode zur Synthese von HNFs. Längere Inkubation, Scherbeanspruchung und Ultraschallbehandlung der Reaktionsmischung sind die am häufigsten berichteten Ansätze zur Herstellung von HNFs. In diesem Zusammenhang wurde die Konzentration der eingebauten Kobalt(II)-Ionen und des Phosphatpuffers optimiert, um die höchste Aktivitätsrückgewinnung zu erreichen. Durch die Einführung einer relativ hohen Konzentration an Vorläufern in die Reaktionsmischung wurden Laccase@Co3(PO4)2·HNFs durch ein schnelles anisotropes Wachstum von Laccase-Kobaltphosphat-Nanokristallen sofort synthetisiert und ein neuer Mechanismus für die Synthese von HNFs vorgeschlagen . Die biokatalytischen Eigenschaften von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs wurden untersucht und auch die Struktur des hybridisierten Enzyms charakterisiert. Die synthetisierten HNFs wurden dann zur Entfernung von Moxifloxacin aus wässrigen Medien eingesetzt. Die Abbauprodukte wurden identifiziert und ihre Toxizität gegenüber vier am Abbau organischer Verbindungen beteiligten Bakterien bewertet.

Laccase aus Trametes versicolor (0,5 U mg−1) und 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) bezogen. Kobalt(II)-chlorid-Hexahydrat (CoCl2.6H2O) wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Alle anderen verwendeten Reagenzien und Chemikalien waren ohne weitere Reinigung von analytischer Qualität. Moxifloxacin wurde freundlicherweise von der Soha Pharmaceutical Company (Teheran, Iran) geschenkt.

Unabhängig von den herkömmlichen Methoden wurde für die Konstruktion von HNFs eine Sofortstrategie angewendet. Das Syntheseverfahren wurde durch Zugabe von 0,1 ml CoCl2-Lösung zu 0,9 ml Phosphatpuffer (pH 7,4) mit 0,1 U ml−1 Laccase durchgeführt. Sofort erschien eine große Anzahl violetter Niederschläge in der Lösung. Die richtige Konzentration von CoCl2 und die Molarität des Phosphatpuffers wurden anschließend im Hinblick auf die höchste Aktivitätsrückgewinnung optimiert (n = 3, p-Wert < 0,05). Die Niederschläge wurden bei 6000 g zentrifugiert und dreimal mit Phosphatpuffer gewaschen. Die violetten Produkte wurden als Laccase@Co3(PO4)2·HNFs markiert.

Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder (Tescan, MIRA II, Tschechische Republik) wurden verwendet, um die blütenförmige Morphologie der hergestellten HNFs anzuzeigen. Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX, Tescan, MIRA II, Tschechische Republik) und Elementkartierung wurden einbezogen, um die Zusammensetzung bzw. räumliche Verteilung der Elemente in den konstruierten HNFs zu bestimmen. Die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) (Shimadzu, Equinox 55, Japan) wurde zur Analyse funktioneller Gruppen organischer und anorganischer Bestandteile von HNFs eingesetzt. Die Proben wurden in gepressten KBr-Scheiben dispergiert und die Spektren wurden bei 4000–400 cm−1 aufgenommen. Die Brunauer-Emmett-Teller-Analyse (BET) wurde nach Entgasung der Proben unter N2 durchgeführt (Microtrac, BELSORP MINI X, Japan). Zur Identifizierung der kristallinen Phase der anorganischen Komponente wurden Röntgenbeugungsanalysen (XRD) mit einem Röntgendiffraktometer (Philips, PW1730, Philips, Eindhoven, Niederlande) durchgeführt.

Die Laccase-Aktivität wurde spektroskopisch gemessen, gefolgt von der Oxidation von ABTS als Enzymsubstrat zum Radikalkation ABTS•+ in Phosphatpuffer (10 mM, pH 4,5)33. Laccase@Co3(PO4)2·HNFs und das freie Enzym wurden mit 1 ml ABTS-Lösung (50 µM, pH 4,5) bei 40 °C in einem Schüttelinkubator inkubiert. Nach 15-minütiger Inkubation wurde die optische Dichte der Überstände bei 420 nm aufgezeichnet. Eine Aktivitätseinheit wurde als die Menge an Laccase definiert, die in der Lage ist, 1 µmol ABTS in 1 Minute zum gefärbten Produkt zu oxidieren. Der Einfluss von pH-Wert und Temperatur auf die Aktivität sowohl von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs als auch der freien Form von Laccase wurde im Temperaturbereich von 25–55 °C (Intervall 10 °C) und im pH-Bereich von 2,5–55 °C bestimmt. 9,5 (Intervall 1) (n = 3, p-Wert < 0,05).

Nach der Herstellung von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs wurde die Konzentration des restlichen Proteins im Überstand mit der Bicinchoninsäure (BCA)-Methode geschätzt34. Die Menge des immobilisierten Enzyms und die Immobilisierungsausbeute (IY)7 wurden nach Gleichung berechnet. (1) und Gl. (2) bzw.

wobei MIL und ML die Mengen der immobilisierten bzw. der hinzugefügten Laccase (µg) zur Immobilisierungsmischung sind; CP und VIm waren für die Konzentration des Restproteins im Überstand und das Volumen der Immobilisierungsmischung verantwortlich.

wobei Y0 und Y1 die Menge des immobilisierten Enzyms in HNFs vor bzw. nach dem Synthesevorgang darstellen.

Die Immobilisierungseffizienz (IE) wurde durch Gleichung erhalten. (3), wobei E0 und Et die Aktivität der freien Laccase bzw. Laccase@Co3(PO4)2·HNFs demonstrieren.

Um den Einfluss der Immobilisierung auf das eingesetzte Enzym zu beurteilen, wurden kinetische Parameter von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs und der freien Laccase bewertet. Um den Einfluss der Immobilisierung auf die Enzymaktivität bei verschiedenen pH-Werten zu untersuchen, wurden die kinetischen Parameter bei pH 4,5 und 7,4 untersucht. Die Aktivität sowohl der freien als auch der immobilisierten Enzyme wurde in Gegenwart von ABTS-Konzentrationen (20–100 µM) bestimmt. Nach Zugabe der ABTS-Lösung (pH 4,5 und 7,4) zu den freien und immobilisierten Enzymen wurde die Reaktionsmischung 15 Minuten lang in einem Schüttelinkubator (bei 40 °C) inkubiert und die optische Dichte des Überstands bei 420 nm aufgezeichnet . Zur Auswertung kinetischer Parameter wie der Michaelis-Konstante (Km) und der Maximalgeschwindigkeit (Vmax) wurde ein Lineaweaver-Burke-Diagramm integriert. Umsatzzahl (Kcat) und katalytische Effizienz wurden ebenfalls basierend auf Gl. berechnet. (4) und Gl. (5)35,36,37; wobei [E] die Konzentration des Enzyms ist.

Um die Wiederverwendbarkeit des konstruierten Biokatalysators zu bewerten, wurde die wiederholte Messung der Aktivität von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs untersucht21. Die hergestellten HNFs wurden in 1 ml Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,4), der ABTS (0,5 mM) enthielt, 15 Minuten lang bei 40 °C inkubiert. Nach der Zentrifugation der Mischung wurde die OD420 des Überstands aufgezeichnet und die Niederschläge dreimal mit Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,4) gewaschen. Der Vorgang wurde so weit wiederholt, dass die Aktivität der HNFs auf unter 50 % ihres Anfangswerts sank (n = 3, p-Wert < 0,05). Die Stabilität der freien Laccase und HNFs wurde als Funktion der wiederhergestellten Aktivität nach 3-stündiger Inkubation bei Temperaturen im Bereich von 25–55 °C (Intervall 10 °C) und einem breiten pH-Bereich von 2,5–9,5 (Intervall 1) bewertet. Die Lagerstabilität der freien Laccase und HNFs wurde durch Messung der Laccase-Aktivität während der Lagerung bei 4 °C (n = 3, p-Wert < 0,05) ermittelt.

Um die Konformationsänderungen von Laccase nach der Immobilisierung zu bewerten, wurden Fern-UV-Zirkulardichroismus (CD) und Fluoreszenzspektroskopien eingesetzt. CD-Spektren von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs und dem freien Enzym wurden mit einem Jasco 725-Spektrophotometer in einer Zelle mit 2 mm Schichtdicke aufgezeichnet, und die Absorption wurde bei 190–240 nm aufgezeichnet. Die Fluoreszenzeigenschaft von Tryptophan hängt von der Tertiärstruktur eines Proteins ab. In diesem Zusammenhang wurde die Tryptophan-Fluoreszenzintensität der freien Laccase und Laccase@Co3(PO4)2·HNFs mit einem Hitachi 850-Spektrofluorometer nach Anregung bei 285 nm33 aufgezeichnet. Schließlich wurde eine thermogravimetrische Analyse (TGA) mit einem thermogravimetrischen Analysegerät (Perkin Elmer STA 6000, USA) zur Bewertung der thermischen Zersetzung sowohl von reinem Kobaltphosphat als auch von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs durchgeführt. Das Experiment wurde unter einer N2-Atmosphäre im Temperaturbereich von 25–600 °C mit einer Heizrate von 10 °C min−1 durchgeführt.

Moxifloxacin wurde mit Laccase@Co3(PO4)2·HNFs und 1-Hydroxybenzotriazol (HBT) als Laccase-Mediator in Phosphatpuffer (10 mM, pH 4,5) bei 40 °C unter Rührbedingungen (100 U/min) inkubiert38. Nach der Bestimmung der Inkubationsdauer wurde die Konzentration von Moxifloxacin durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gekoppelt mit einem UV-Detektor quantifiziert und der Entfernungsprozentsatz basierend auf Gleichung (1) berechnet. (6); da C0 und Ct die Konzentration von Moxifloxacin vor bzw. nach Entfernungs-/Adsorptionsexperimenten darstellen.

Um die Adsorption von Moxifloxacin an den Laccase@Co3(PO4)2·HNFs zu beurteilen, wurde das Experiment mit den inaktivierten HNFs durchgeführt und die Adsorption (%) wurde nach Gleichung (1) berechnet. (5). Zu diesem Zweck wurden Laccase@Co3(PO4)2·HNFs durch aufeinanderfolgende Einfrier- und Auftauzyklen inaktiviert. Die Inaktivierung wurde durch Messung der enzymatischen Aktivität nachgewiesen. Abschließend wurde der Abbau von Moxifloxacin anhand von Gl. berechnet. (7).

Nach dem Entfernungsvorgang wurde der pH-Wert der Reaktionsmischung mit Phosphatpuffer (100 mM, pH 7,95) auf 7,95 (isoelektrischer Punkt von Moxifloxacin) eingestellt. Anschließend wurde die Mischung nach Zugabe von Ciprofloxacin als internem Standard dreimal unter kräftigem Vortex mit Chloroform extrahiert. Das extrahierte Chloroform wurde mit einem Rotationsverdampfer zur Trockne eingedampft und das verbleibende Pulver wurde in 1 ml der mobilen HPLC-Phase gelöst. Für die Moxifloxacin-Quantifizierung wurde ein Knauer HPLC-UV-System (Berlin, Deutschland) mit einem PDA 2800-Detektor, einer Smartline 1000-Pumpe und der ChromGate-Software (Version 3.3.1) eingebaut. Die mobile Phase bestand aus Methanol (45 %) und 10 mM Phosphatpuffer (pH 3,0) (55 %). Die Proben wurden mit dem Smartline-Autosampler 3950 in eine Eurospher 100 C18-Umkehrphasensäule (250 × 4,6 mm) injiziert.

Biotransformationsprodukte von Moxifloxacin wurden durch Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektroskopie (LC-MS) identifiziert. Bei dem Gerät handelte es sich um ein LC-System der Agilent 1200-Serie, gekoppelt mit einem Agilent 6520 Quadrupol-Flugzeit-Tandem-MS-Instrument, das mit einer Elektrospray-Ionenquelle (Agilent, Waldbronn, Deutschland) ausgestattet war. Eine 2,1–100 mm große Nucleosil 100-3 C18 HD-Säule (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) wurde mit einer Flussrate von 0,35 ml/min eingesetzt. Als mobile Phase wurden entionisiertes Wasser + 0,1 % Ameisensäure (40 %) und Acetonitril (60 %) verwendet.

Basierend auf früheren Studien ist die Eliminierung der Toxizität durch den Abbau von Antibiotika in katalytischen Verfahren nicht gewährleistet39. Dementsprechend wurde die Toxizität von Moxifloxacin-Abbauprodukten gegenüber einigen Bakterien untersucht, darunter Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Escherichia coli ATCC 25.922, Staphylococcus epidermidis ATCC 49.619 und Staphylococcus aureus ATCC 6538, die für die biologische Entfernung organischer Schadstoffe in der Umwelt verantwortlich sind. Hierzu wurde die frische Kultur jedes Bakteriums in einer Nährbrühe ausgesät und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde jedes Bakterium mit einer Mischung aus Abbauprodukten behandelt und die optische Dichte (OD) jedes Bakteriums bei 600 nm nach Bestimmung der Inkubationszeiträume bei 37 °C bewertet. Die Wachstumshemmung von Moxifloxacin-Abbauprodukten, Moxifloxacin als Positivkontrolle und sterilem Wasser als Negativkontrolle wurden durch Auftragen von OD600 gegen die Inkubationszeit gemessen (n = 3, p-Wert < 0,05)20.

Die Experimente wurden dreifach durchgeführt und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die statistische Signifikanz des Mittelwerts der experimentellen Ergebnisse wurde durch eine Zwei-Wege-ANOVA (± Standardabweichung) berechnet und ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

HNFs wurden routinemäßig durch Zugabe von Metallionen zu enzymhaltigem PBS und anschließender dreitägiger Inkubation bei Raumtemperatur, kräftigem Vortexen oder Badbeschallung konstruiert, was zu einer erheblichen Belastung des organischen Bestandteils führt21,29,31,32. In der vorliegenden Studie wurden die Konzentration von CoCl2 und die Molarität des Phosphatpuffers (pH 7,4) optimiert, um HNFs sofort herzustellen und stressauslösende Bedingungen in den Synthesevorgang zu vermeiden. Nach der Zugabe von CoCl2 zu Laccase-haltigem Phosphatpuffer bildeten sich sofort die violetten Niederschläge. Der Niederschlag wurde dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen und als Laccase@Co3(PO4)2·HNFs bezeichnet. Wie in Abb. 1a gezeigt, nahm die wiederhergestellte Aktivität bei höherer Molarität des Phosphatpuffers allmählich zu. Die höchste Aktivitätsrückgewinnung wurde jedoch mit HNFs erzielt, die mit 0,16 M Phosphatpuffer und 30 mM CoCl2 hergestellt wurden. In einer Studie von Zheng et al.40 wurden D-Psicose-3-Epimerase (DPEase)@Co3(PO4)2•HNFs durch Inkubation einer Lösung hergestellt, die Co2+ (1,9 mM), Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) enthielt. und DPEase (1 mg mL−1) bei 4 °C für 48 Stunden. In einer anderen Studie wurden Cellobiose-2-Epimerase (Mutante E161D/N365P) (EDNP)@Co3(PO4)2·HNFs durch Zugabe von CoCl2 zu PBS (10 mM, pH 7,4) und 24-stündige Inkubation der Mischung bei erhalten Raumtemperatur41. Die Aktivitätsrückgewinnung nahm mit der Co2+-Konzentration in der Synthesemischung zu, und die höchste Aktivitätsrückgewinnung wurde bei 2 mM Co2+ erreicht. In der vorliegenden Studie wurde die höchste Aktivität erzielt, wenn die Endkonzentration von Co2+ in der Mischung 1,36 mM betrug. Obwohl die Konzentration des in der Synthesemischung enthaltenen Co2+ mit anderen Studien vergleichbar war, war die Molarität des in dieser Studie verwendeten Phosphatpuffers deutlich höher. Eine interessante Untersuchung zum Mechanismus der Bildung von Kupferphosphat-Nanoblumen und auch BSA@Cu3(PO4)2·HNFs wurde von He et al.42 durchgeführt. Es wurde berichtet, dass durch die Erhöhung der Konzentration des eingearbeiteten Phosphatpuffers (pH 7,4) der Ertrag an Kupferphosphat-Nanoblumen zunahm. Die gleichen Ergebnisse wurden in der vorliegenden Studie erzielt, und durch die Zugabe von CoCl2 zu Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,4), der Laccase enthielt, bildeten sich vernachlässigbare Niederschläge, und die Ausbeute an Laccase@Co3(PO4)2·HNFs wurde erhöht die Konzentration des Phosphatpuffers. Daher war die Ausbeute an HNFs bei höheren Phosphatpufferkonzentrationen erhöht. Bei Phosphatpufferkonzentrationen über 0,16 M war die Aktivitätswiederherstellung jedoch deutlich verringert. Dies könnte auf die Bildung einer größeren Menge an Kobaltphosphatkristallen zurückzuführen sein, die die Stoffübergangsbegrenzung erhöht. Um die Wirkung der Inkubation, der am häufigsten beschriebenen Methode für das Wachstum von HNFs, zu überprüfen, wurden die optimierten HNFs 24–72 Stunden lang bei 25 °C inkubiert. In früheren Studien wurde die Inkubation durch Badbeschallung ersetzt, was das Wachstum von HNFs29 beschleunigte. Daher wurden die so vorbereiteten HNFs in bestimmten Zeitintervallen in einem Ultraschallbad (60 kHz, 13,8 W) beschallt. Die Ergebnisse (Abb. 1b) zeigten, dass eine weitere Inkubation die wiederhergestellte Aktivität verringerte, was möglicherweise auf die Denaturierung des Enzyms zurückzuführen ist. Es wurde berichtet, dass Ultraschall die Geschwindigkeit der Selbstorganisation von Metallphosphaten erhöht, was das Wachstum von HNFs fördert29. Die Ultraschallbehandlung des Reaktionsgemisches (bis zu 20 Minuten, 5-Minuten-Intervalle) erhöhte die wiederhergestellte Aktivität nicht. Dies kann auf den Abschluss des Wachstums von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs in einem relativ kurzen Zeitraum zurückzuführen sein; Daher veränderte eine weitere Inkubation oder Ultraschallbehandlung die wiederhergestellte Aktivität nicht. Die genannte Synthesemethode wird in der vorliegenden Studie zum Vergleich mit den bisher berichteten und traditionellen Verfahren als „konzentrierte Methode“ bezeichnet. Die vorliegende Erklärung des Bildungsmechanismus von HNFs basiert auf der Keimbildung primärer Metallphosphat-Protein-Nanokristalle und dem anschließenden anisotropen Wachstum der Hybrid-Nanoaggregate. Aufgrund der hohen Oberflächenenergie der primären proteinanorganischen Nanokristalle neigen sie dazu, sich anzulagern und Nanoblattstrukturen zu bilden, die schließlich die endgültige Struktur von HNFs22 bilden. Das Wachstum der Keimbildungsstellen von HNFs könnte durch eine Erhöhung der Kollisionsrate der Primärkristalle erleichtert werden43. Es scheint, dass die Einführung bestimmter Mengen kinetischer Energie, bereitgestellt durch Langzeitinkubation (24–72 Stunden bei 25 °C), Badbeschallung, Mikrowellenerwärmung und Scherbeanspruchung, in die Synthesemischung (organische Komponente, Metall usw.) Phosphationen) könnten die Bildung von HNFs induzieren. Die Anzahl der primären Keimbildungsstellen erhöhte sich durch den Einbau einer hohen Konzentration an Kobalt(II)- und Phosphationen in die Reaktionsmischung. Basierend auf Gl. (8), eine größere Anzahl von Nanokristallen kollidiert möglicherweise häufiger miteinander und HNFs wurden sehr schnell hergestellt43. In Gl. (8), z ist die Kollisionsfrequenz, D ist der Partikeldurchmesser, ῡ stellt die mittlere Geschwindigkeit der dispergierten Partikel dar, N ist die Gesamtzahl der Partikel und V ist das Gesamtvolumen der Reaktionsmischung.

Optimierung des Syntheseverfahrens. Die Synthese von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs durch Optimierung der Konzentration von Phosphat- und Kobalt(II)-Ionen (a), der Einfluss der Inkubation (bei 25 °C) als herkömmliche Verfahren zur Konstruktion von HNFs auf die wiederhergestellte Aktivität des heterogenen Biokatalysators (b).

Hybride Nanoblumen wurden in kurzer Zeit durch kräftiges Vortexen30 und Badbeschallung29 der Vorläufer synthetisiert, was die mittlere Geschwindigkeit der dispergierten Partikel erhöhte (ῡ). Basierend auf Gl. (8) Nach der Erhöhung der mittleren Geschwindigkeit dispergierter organisch-anorganischer Partikel durch Vortexen oder Badbeschallung nimmt die Kollisionsfrequenz zu, was zu einem schnellen anisotropen Wachstum der HNFs führt.

Die blütenförmige Morphologie der hergestellten HNFs (Abb. 2a) wurde durch REM-Aufnahmen bestätigt. Die Größe der Laccase@Co3(PO4)2·HNFs lag im Bereich von 0,5–3 µm und wurde durch miteinander verbundene Nanoblätter zusammengesetzt, was zu einem hohen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen führte (Abb. 2b). Kobaltphosphat-Nanoblumen (NFs) wurden ebenfalls auf dem gleichen Syntheseweg hergestellt, ohne dass Laccase in die Reaktionsmischung eingearbeitet wurde. Wie in Abb. S1 und S2 gezeigt, zeigten die Kobaltphosphat-NFs auch eine blütenähnliche Morphologie. In einigen früheren Studien wurde berichtet, dass die blütenförmige Morphologie von HNFs auf das Vorhandensein anorganischer Bestandteile zurückzuführen ist 44, 45. Außerdem wurde berichtet, dass die 3D-Struktur der eingebauten organischen Komponente die Morphologie von HNFs verändern könnte46. Allerdings wurde anorganisches Kupferphosphat mit dem gleichen Syntheseverfahren hergestellt, das die gleiche blütenförmige Morphologie aufwies wie Protein@Cu3(PO4)2·HNFs42,47,48,49. Insgesamt lässt sich der Schluss ziehen, dass einige Metallphosphate eine blütenartige Morphologie aufweisen50, die nach Hybridisierung mit Proteinen verändert werden könnte. Die EDX-Analyse von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs und Kobaltphosphat-Nanoblumen ist in Abb. 2d bzw. Abb. S4 dargestellt. Der Gewichtsprozentsatz der Elemente sowohl in konstruierten HNFs als auch in Kobaltphosphat ist in Tabelle S1 zusammengefasst. Das Vorhandensein von Stickstoffatomen in den hergestellten HNFs bestätigt die Immobilisierung von Laccase im Träger. Die Elementarkartenanalyse (Abb. 2c) liefert auch Informationen über die homogene Verteilung von Co-, P-, N- und O-Atomen in den konstruierten HNFs. Um den anorganischen Teil von Laccase@Co3(PO4)2·HNF zu identifizieren, wurde die XRD-Analyse durchgeführt. Die erhaltenen Peaks von Laccase@Co3(PO4)2·HNF stimmten gut mit dem Standard-Kobaltphosphatmuster (JCPDS 00–027-1120) überein (Abb. 3). Der mittlere Porendurchmesser, das Gesamtporenvolumen und die spezifische Oberfläche der hergestellten HNFs und Co3(PO4)2·NFs sind in Tabelle S2 zusammengefasst, und entsprechende BET-Diagramme sind in Abb. S5 dargestellt. Die hohe spezifische Oberfläche (17,42 m2 g−1) stimmt mit der nanoskaligen Breite der Blütenblätter im REM-Bild von Laccase@Co3(PO4)2 überein. Wie gezeigt, war die spezifische Oberfläche von Co3(PO4)2•NFs und den synthetisierten HNFs nahezu identisch. Das Vorhandensein einer Typ-IV-Isotherme in den BET-Diagrammen ist auf die mesoporöse Struktur der synthetisierten Materialien zurückzuführen. Als Faustregel gilt, dass die größere Oberfläche des immobilisierten Enzyms die Zugänglichkeit des Substrats für das Enzym erhöht und die biokatalytische Effizienz erhöht51. Die gleichen Ergebnisse wurden für Laccase@Cu3(PO4)2·HNFs (10,2 m2 g−1) und GOx@Cu3(PO4)2·HNFs (17,9 m2 g−1) berichtet52,53. FTIR-Spektren von Laccase, Co3(PO4)2 und Laccase@Co3(PO4)2·HNFs sind in Abb. 4a dargestellt. Wie gezeigt, sind charakteristische Schwingungsfrequenzen im Bereich von 725–1300 cm−1 auf das Vorhandensein von Phosphatgruppen zurückzuführen54. Peaks bei 2980–3600 cm−1 wurden auf das Vorhandensein von CH2- und CH3-Gruppen in Laccase@Co3(PO4)2·HNFs54 zurückgeführt. Die breite Bande bei 3200–3500 cm−1 entspricht der O-H-Streckschwingungsbande55. Ein Peak bei 1640 cm−1 wird der Amid(I)-Bande von Laccase zugeschrieben; es überlappt jedoch mit der Absorptionsbande von eingeschlossenem Wasser in Laccase@Co3(PO4)2·HNFs56,57.

Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bildgebung. SEM-Bild (a,b), Elementkarte (c) und energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX)-Analyse (d) der konstruierten Laccase@Co3(PO4)2·HNFs.

Röntgenbeugungsanalyse (XRD). Röntgenspektrum von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs (a), XRD-Muster von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs und dem Standard Co3(PO4)2 (JCPDS–00–027–1120) (b) .

FT-IR-Analyse. Die Spektren der Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs (durchgezogene Linie), Co3(PO4)2 (lange gestrichelte Linie) und dem freien Enzym (gestrichelter Punkt) (a). Wiederverwendbarkeit von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs (b). Die Aktivität von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs sank nach 11 Wiederverwendbarkeitszyklen auf unter 50 % der ursprünglichen Aktivität. Lagerstabilität von Laccase@Co3(PO4)2•HNFs und der freien Laccase nach 40 Tagen Lagerung bei 4 °C (c). Bioentfernung von Moxifloxacin durch Laccase@Co3(PO4)2·HNFs und inaktivierte Laccase@Co3(PO4)2·HNFs. Die Experimente wurden bei 40 °C in Phosphatpuffer (10 mM, pH 4,5) durchgeführt (d).

CD-Spektren wurden angewendet, um den Effekt der Immobilisierung auf die Sekundärstruktur von Laccase aufzuklären (Abb. S6). Wie in Tabelle 1 zusammengefasst, bestand die Konformation der freien nativen Laccase hauptsächlich aus β-Faltblättern (44,4 %), β-Windungen (11,3 %) und Zufallsknäueln (39,8 %). Dennoch stieg die Menge an α-Helix in der Sekundärstruktur von Laccase nach der Immobilisierung von Laccase in kobaltbasierten HNFs deutlich an (32 %). Der Gehalt an β-Turns nahm leicht ab; allerdings war der β-Faltblatt-Gehalt (10,3 %) der Laccase deutlich reduziert. Laccase aus T. versicolor besteht hauptsächlich aus β-Faltblättern, β-Turns und anderen Strukturen, wie bereits berichtet58,59. Höhere α-Helix-Anteile führen zu einer steiferen Proteinstruktur, die auf der Bildung einer höheren Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen beruht. Durch die Verringerung der β-Faltblätter und die Erhöhung des α-Helix-Gehalts wurde die Laccase-Sekundärstruktur steifer60. Auf den ersten Blick ist es nicht weit hergeholt, dass die Enzymaktivität nach einer solchen Veränderung der Proteinstruktur vollständig nachlässt. Allerdings kann die Immobilisierung von Enzymen die Proteinstruktur ohne Aktivitätsverlust erheblich verändern. Beispielsweise wird durch die Herstellung vernetzter Enzymaggregate die 3D-Struktur des Enzyms deutlich verändert. Zur Immobilisierung des Enzyms wurde vernetzte, aggregierte Laccase verwendet; währenddessen blieb die biokatalytische Aktivität des Enzyms erhalten61,62,63. Um die Auswirkung einer Änderung der Tertiärstruktur der Laccase zu überprüfen, wurde Fluoreszenzspektroskopie eingesetzt. Die umgebende Mikroumgebung hat großen Einfluss auf die Fluoreszenzeigenschaften von Tryptophan; Folglich stellt jede Veränderung in der Tryptophan-Mikroumgebung eine Proteinfaltung dar. Wie in Abb. S7 gezeigt, war die Fluoreszenzintensität von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs geringer als die des freien Enzyms, was auf die erhebliche Veränderung in der tertiären Enzymstruktur hinweist64. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Immobilisierung von Laccase in Kobaltphosphat-HNFs den Gehalt an α-Helix erhöht, was letztendlich die Tertiärstruktur des Proteins verändert. Wie in Abb. S8 gezeigt, war der Gewichtsverlust von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs höher als der der reinen anorganischen Nanoblumen, was darauf hinweist, dass 5 % des Gewichts der HNFs aus Laccase bestehen. Der Gesamtgewichtsverlust von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs bei der Zersetzung betrug 28,02 %. Der anfängliche Gewichtsverlust der Proben (6 % bei 100–160 °C) war auf die Verdunstung von im Kobaltphosphat eingeschlossenem Kristallwasser zurückzuführen. Im zweiten Stadium wird der Gewichtsverlust auf den Abbau immobilisierter Laccase zurückgeführt, der bei 22 % lag.

Um die optimalen Bedingungen für die Aktivität von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs zu bestimmen, wurde die Enzymaktivität in einem breiten pH- und Temperaturbereich gemessen. Wie in Abb. 5a,b gezeigt, war die Aktivität der Laccase@Co3(PO4)2·HNFs bei basischen pH-Werten deutlich höher als die des freien Enzyms. Die maximale Aktivität sowohl der Laccase@Co3(PO4)2·HNFs als auch des freien Enzyms wurde jedoch bei einem pH-Bereich von 4,5–5,5 und 45 °C erreicht. Ähnliche Ergebnisse wurden von Patel et al.65 erzielt, da die Aktivität vernetzter Laccase@Cu3(PO4)2·HNFs bei pH 4–7 deutlich höher war als die des freien Enzyms. Die geeignete Anpassung des Enzyms an die umgebende Mikroumgebung war für den Anstieg der Aktivität von Laccase in einem breiteren pH-Bereich verantwortlich65. Es wurde jedoch berichtet, dass die folgenden Mechanismen für die Verbesserung der Laccase-Aktivität nach der Immobilisierung in HNFs verantwortlich sind: (i) große Oberfläche und poröse Struktur von HNFs, (ii) allosterische Wirkung der anorganischen Komponente auf aktive Zentren des Enzyms und (iii ) günstige Konformation des eingeschlossenen Enzyms66,67. Es ist bekannt, dass die Immobilisierung von Enzymen auf Trägern mit großer Oberfläche aufgrund der höheren Enzymbeladung günstig ist68. Außerdem führt die große Oberfläche des immobilisierten Enzyms zu einem effizienten Massentransport des Substrats zum Enzym, wodurch die Aktivität des Biokatalysators verbessert werden kann69. Es wurde berichtet, dass die allosterische Wirkung von Kupferionen mit Laccase die enzymatische Aktivität deutlich verbessert70. Auch die katalytische Aktivität der in CaHPO4-Nanoblumen immobilisierten α-Amylase wurde aufgrund der allosterischen Wirkung von Ca2+ verbessert. Über den allosterischen Effekt von Co2+ auf die aktiven Zentren der Laccase wurde bisher jedoch nicht berichtet. Daher konnte der Schluss gezogen werden, dass die große Oberfläche von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs die Stofftransferbeschränkung verringerte und das Substrat somit effizient auf das aktive Zentrum des Enzyms zugriff. Es wird angenommen, dass hohe Temperaturen und ein extrem saurer oder basischer pH-Wert die Aktivität und Stabilität der Enzyme durch die Induktion von Konformationsänderungen verringern71. Es wurde jedoch gezeigt, dass die Hybridisierung von Nitrilhydratase (NHase) mit Kobaltphosphatkomplexen die Stabilität von NHase gegenüber Temperatur erhöhte72. Ebenso wurde die Aktivität von Laccase nach dem Einbau in Laccase@Cu3(PO4)2·HNFs71 um 165 % erhöht. Eine stabile Koordination von Laccase mit Kobaltphosphat führt wahrscheinlich zu einer höheren Betriebsstabilität des Enzyms.

Stabilitäts- und Aktivitätsstudien. Einfluss von pH-Wert und Temperatur auf die Aktivität (a) und Stabilität des freien Enzyms (c). Einfluss von pH-Wert und Temperatur auf die Aktivität (b) und Stabilität von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs (d).

Aufgrund der verbesserten enzymatischen Aktivität der synthetisierten HNFs bei basischen pH-Werten wurden die kinetischen Eigenschaften der immobilisierten und freien Laccase bei pH 4,5 und 7,4 bewertet. Immobilisierungsausbeute, Effizienz und kinetische Eigenschaften der sofort hergestellten Laccase@Co3(PO4)2·HNFs und des freien Enzyms sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die IY (%) und IE (%) betrugen 65,3 ± 7,6 und 110 ± 4,9. die mit früheren Studien vergleichbar waren. Es wurde berichtet, dass Laccase auf den Amino-funktionalisierten Metall-organischen Gerüsten immobilisiert wurde, die 93,8 % ihrer ursprünglichen Aktivität beibehielten. Die Enzymbeladung (%) erreichte ≈10 % bzw. ≈70 % nach 1 Stunde bzw. 4 Stunden Immobilisierung73. Zur Entfärbung von Melanoidinen wurde auch Laccase auf den aktivierten Aluminiumoxidpellets immobilisiert. Der Immobilisierungsprozess bei der 5-stündigen Inkubation von Laccase mit dem Träger und die IY (%) und IE (%) betrugen 87,5 % bzw. 97 %74. Laccase-Lysin@Cu3(PO4)2·HNFs wurden durch 72-stündige Inkubation der Synthesemischung hergestellt, und die IY (%) und Aktivitätsrückgewinnung betrugen 71 % bzw. 270 %. Es wurde berichtet, dass die hergestellten HNFs eine duale Oxidase- und Peroxidaseaktivität aufwiesen. Die bemerkenswerte Steigerung der enzymatischen Aktivität nach der Immobilisierung führte zu einer günstigen Konformationsänderung der Laccase aufgrund des Vorhandenseins von Kupferionen und Lysin in der Struktur von HNFs70.

Immobilisierungseffizienz, Vmax und Km der Biokatalysatoren waren unter basischen und sauren Bedingungen unterschiedlich. Der Vmax-Wert der Laccase@Co3(PO4)2·HNFs war bei pH 7,4 40 % höher als bei pH 4,5; Allerdings sank die maximale Geschwindigkeit des freien Enzyms bei pH 7,4 um 21,2 %. Ebenso wurde die Effizienz des Immobilisierungsverfahrens bei pH 7,4 um 25 % gesteigert. Die Ergebnisse zeigten, dass Kcat von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs bei pH 7,4 höher war als das freie Enzym; während das freie Enzym bei pH 4,5 einen überlegenen Kcat gegenüber Laccase@Co3(PO4)2·HNFs aufwies. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Wirkung des pH-Werts auf die Aktivität sowohl der freien als auch der immobilisierten Laccase. Die Michaelis-Konstante (Km) gibt die Affinität des Enzyms zum Substrat an, und ein niedriger Km-Wert zeigt die hohe Affinität des Enzyms zum Substrat bei beiden pH-Werten an. Die verbesserte Zugänglichkeit von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs zum Substrat (im Vergleich zum freien Enzym) könnte auf die große Oberfläche der blütenförmigen Strukturen zurückgeführt werden, die die Stofftransferbeschränkungen verringert75. Normalerweise können sich Km, Vmax und die optimalen Bedingungen zum Erreichen der höchsten katalytischen Effizienz der Enzyme nach der Immobilisierung ändern76. Es wurde berichtet, dass die maximale Aktivität von Pilzlaccasen bei einem pH-Bereich von 3–577 erreichbar ist. Eine ihrer Haupteinschränkungen ist trotz des hohen Redoxpotentials der Pilzlaccasen (490–790 mV) eine unzureichende Aktivität unter neutralen und alkalischen Bedingungen. In dieser Hinsicht sind pH-tolerante Laccasen für industrielle und ökologische Zwecke wünschenswert78. Die Hybridisierung von Laccase mit Kobaltphosphat-Nanokristallen erhöhte die Toleranz der Laccase von T. versicolor gegenüber alkalischen Bedingungen, was ihre Attraktivität für industrielle und ökologische Anwendungen verbessern könnte79.

Die Wiederverwendbarkeit ist ein wichtiges Merkmal von Biokatalysatoren, das ihre Nutzungskosten, insbesondere im industriellen Maßstab, senkt. In der vorliegenden Studie lieferte die Messung der Wiederverwendbarkeit von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs jedoch Hinweise auf die erfolgreiche Immobilisierung von Laccase in der Kobaltphosphatmatrix. Um die Wiederverwendbarkeit von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs zu bewerten, wurde die Enzymaktivität nacheinander mit ABTS als Substrat gemessen. Wie in Abb. 4b gezeigt, änderte sich die Aktivität der Laccase@Co3(PO4)2·HNFs nach vier aufeinanderfolgenden Wiederverwendungszyklen nicht wesentlich. Allerdings sank die Enzymaktivität nach 10 Wiederverwendungszyklen auf 50 % ihres ursprünglichen Wertes. Die Ergebnisse zeigen, dass Laccase@Co3(PO4)2·HNFs eine bemerkenswerte Wiederverwendbarkeit aufwiesen und das Enzym erfolgreich in der Matrix aus Kobaltphosphat immobilisiert wurde. Laccase-basierte HNFs zeigten eine vielversprechende Wiederverwendbarkeit; Beispielsweise behielten Laccase- und Lysin-Kupfer-HNFs nach 6 Wiederverwendbarkeitszyklen 60 % ihrer ursprünglichen Aktivität bei81. In einer anderen Studie behielten Laccase-Kupfer-HNFs nach 10 Wiederverwendbarkeitsläufen 50 % der ursprünglichen Aktivität; Allerdings behielten die mit Glutaraldehyd behandelten HNFs unter den gleichen Bedingungen fast 100 % ihrer ursprünglichen Aktivität65. Wie in Abb. 5c,d gezeigt, war die Stabilität von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs gegenüber erhöhten Temperaturen und basischen pH-Werten höher als die der freien Laccase. Laccase@Co3(PO4)2·HNFs behielten 50 % ihrer Aktivität nach 3-stündiger Inkubation bei pH 9,5, wobei die freie Laccase fast ihre gesamte Aktivität verlor. Es ist zu beachten, dass die Stabilität von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs bei sauren pH-Werten aufgrund der Löslichkeit von Kobaltphosphat bei sauren pH-Werten von 25 geringer war als die des freien Enzyms. Es liegen keine Vergleichsdaten vor. Wie in 3.3 erwähnt, war der α-Helix-Gehalt der Laccase nach der Hybridisierung mit Kobaltphosphat erhöht. Kupferionen der Laccase, die an der katalytischen Aktivität des Enzyms beteiligt sind, sind in β-Faltblättern vorhanden, die hauptsächlich aus konservierten polaren Aminosäuren bestehen82. Es wurde berichtet, dass die Stabilität und Aktivität von Laccase zunimmt, wenn der Gehalt an α-Helix zunimmt und der Gehalt an β-Faltblättern abnimmt20,60,83. Eine starrere Proteinstruktur, die mit einem zunehmenden α-Helix-Gehalt einhergeht, könnte die höhere Stabilität von Laccase-HNFs im Vergleich zum freien Enzym erklären20. Allerdings wurde die Stabilität von Enzymen, die auf kobaltbasierten Trägern immobilisiert waren, erhöht84. Beispielsweise wurde Laccase auf den MOFs auf Co2+- und Cu2+-Basis immobilisiert, was zu einer Verbesserung ihrer enzymatischen Aktivität führte. Die Laccase-Co2+- und Laccase-Cu2+-MOFs behielten nach 4-wöchiger Lagerung bei Raumtemperatur 66 % bzw. 58 % ihrer ursprünglichen Aktivität, was auf die überlegene Stabilisierung von Laccase durch Co2+-basiertes MOF85 hinweist. Die thermische Stabilität von Laccase wurde nach dem Einbau in Laccase@Cu3(PO4)2·HNFs71 verbessert. In einer anderen Studie wurde Laccase auf den Nanopartikeln CoFe2O4, Fe3O4 und NiFe2O4 immobilisiert. Laccase-CoFe2O4, Laccase-Fe3O4, Laccase-NiFe2O4 und die freie Laccase behielten ≈80 %, ≈70 %, ≈40 % bzw. 0 % ihrer ursprünglichen Aktivität nach 30-tägiger Inkubation bei 25 °C86. Es wurde berichtet, dass 43 % bzw. 22 % der Laccase@Cu3(PO4)2·HNFs bzw. des freien Enzyms nach 30-minütiger Inkubation bei 80 °C erhalten blieben. Es wurde berichtet, dass die Konformationsstabilität und Steifheit der immobilisierten Laccase für die Stabilisierung der Laccase verantwortlich waren. Graphenoxid-Laccase-HNFs wurden zur effizienten Farbstoffentfernung von Kristallviolett (CV) und Neutralrot (NR) synthetisiert. Nach 60-minütiger Inkubation bei 70 °C behielten die freie und die immobilisierte Laccase 57 % bzw. 71 % ihrer ursprünglichen Aktivität75. Die Immobilisierung von Laccase in Laccase@Co3(PO4)2·HNFs erhöhte die Lagerstabilität des Enzyms. Wie in Abb. 4c gezeigt, verloren die vorbereiteten HNFs nach 40 Tagen Lagerung bei 4 °C 20 % der anfänglichen Aktivität, während das freie Enzym 58 % der anfänglichen Aktivität verlor.

Wie in Abb. 4d gezeigt, konnten Laccase@Co3(PO4)2·HNFs Moxifloxacin deutlich entfernen. Das Antibiotikum wurde durch die hergestellten HNFs sowohl durch Abbau- als auch durch Adsorptionsmechanismen nahezu vollständig (99 %) aus dem Reaktionsgemisch eliminiert. Um die Adsorption von Moxifloxacin an den konstruierten HNFs gezielt zu bestimmen, wurde das Antibiotikum mit deaktivierter immobilisierter Laccase behandelt. Daher wurde das Ausmaß der Moxifloxacin-Entfernung durch deaktivierte Laccase@Co3(PO4)2·HNFs für den Adsorptionsmechanismus verantwortlich gemacht. Die Adsorption an der Oberfläche von HNFs war für 24 % der Moxifloxacin-Entfernung nach 18-stündiger Behandlung verantwortlich, und die maximale Adsorptionskapazität deaktivierter Laccase@Co3(PO4)2·HNFs für dieses Antibiotikum betrug 0,8 mg g−1. In einer aktuellen Studie wurde Doxorubicin mithilfe magnetischer Nanoblumen aus Kupferphosphat aus menschlichem Urin entfernt. Es wurde berichtet, dass Metallionen wie Cu(II), Fe(II oder III) und Mn(II) durch Komplexierung mit dem Aglyconring und der Zuckereinheit von Doxorubicin an dieses Antitumorantibiotikum binden können49. Es wurde zuvor berichtet, dass Metall2+-Ionen über einen Komplexierungsmechanismus mit 4-Oxo- und benachbarten Carboxylgruppen der Chinoloneinheit Komplexe mit Chinolon-ähnlichen Antibiotika bilden können. Daher könnte die Komplexierung von Chinolon-ähnlichen Antibiotika mit Metall2+-Ionen für deren Adsorption genutzt werden87,88. Wie Wu et al. 89, Montmorillonit und Kaolinit adsorbierten Nalidixinsäure durch die Komplexierung mit der C-3-Carboxylgruppe (OH) und der C-4-Oxogruppe dieses synthetischen Fluorchinolons. Die maximale Adsorptionskapazität von Montmorillonit und Kaolinit für Nalidixinsäure betrug 24 bzw. 1,03 mg g-189.

Wie gezeigt, erreichte der Abbau von Moxifloxacin durch Laccase@Co3(PO4)2·HNFs nach 18-stündiger Behandlung ein Plateau und machte 75 % seiner Entfernung aus. Über die Eliminierung von Moxifloxacin durch Laccase wurde bisher nicht berichtet; andere Chinolon-ähnliche Antibiotika wie Ciprofloxacin und Ofloxacin wurden jedoch durch Laccase effizient entfernt90,91,92. In dieser Studie wurde Moxifloxacin durch Laccase@Co3(PO4)2·HNFs in Gegenwart von HBT, einem Laccase-Mediator, entfernt. Mehrere Arten von Arzneimitteln können aufgrund ihres hohen Redoxpotentials (E°)93 nicht durch Laccasen abgebaut werden, beispielsweise Chinolon-ähnliche Antibiotika. Laccase/Mediator-Systeme (LMS) wurden eingesetzt, um diese Einschränkung zu überwinden, indem das Oxidationspotential von Laccase in Richtung hoher E° organischer Verbindungen erhöht wurde93. Die durch die Oxidation von Mediatoren durch Laccase erzeugten freien Radikale können eine Vielzahl organischer Substanzen effizient oxidieren. Tatsächlich fungieren Mediatoren als Redox-Shuttles zwischen aktiven Zentren der Laccase und Substraten mit hohem Redoxpotential94. Durch die Zugabe von HBT wurden 40 % bzw. 75 % des Moxifloxacins nach 6 bzw. 24 Stunden Behandlung abgebaut. Die gleichen Ergebnisse wurden für den Abbau von Isobutylparaben (iso-BP) und n-Butylparaben (n-BP) durch das Laccase/HBT-Oxidationssystem berichtet. Da Laccase iso-BP und n-BP nicht entfernen konnte, wurden sie durch das Laccase/HBT-System (2 mM) fast vollständig entfernt95. In einer anderen Studie wurde Laccase aus Coriolopsis gallica UAMH8260 zum Abbau einiger Textilfarbstoffe verwendet. Es wurde berichtet, dass das Enzym 13 synthetische Textilfarbstoffe entfärben konnte; Das Laccase/HBT-System (1 mM) konnte jedoch 26 Textilfarbstoffe effizient entfernen96.

Nach dem Bioentfernungsverfahren wurde die Mischung der biotransformierten Moxifloxacin-Produkte einer LC-MS-Analyse unterzogen. Die wichtigsten Nebenprodukte, ihre Retentionszeiten und das entsprechende Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) sind in Abb. S9 dargestellt. Basierend auf den LC-MS-Ergebnissen werden fünf plausible Wege für den Abbau von Moxifloxacin vorgeschlagen (Abb. 6). Interessanterweise ersetzte der Biokatalysator die Fluoratome von Moxifloxacin, das für die geringe biologische Abbaubarkeit von FQs verantwortlich ist, durch Hydroxylgruppen (Verbindung III; m/z + 1 = 262, Rt = 6 min)90. Wie gezeigt, waren die Ringöffnung der Piperazineinheit und weitere Demethylierungsreaktionen für das Auftreten von Verbindung VI (m/z = 307, Spur) bzw. Verbindung II (m/z + 1 = 280, Rt = 3,9 min) verantwortlich (Weg I). ). Im Weg II durchlief Moxifloxacin eine Defluorierung und Spaltung der Piperazineinheit (Verbindung VII; m/z = 388, Spur) und wandelte sich nach Dihydroxylierung und Demethylierung weiter in Verbindung V (m/z = 358, Rt = 9,8 min) um97. Im dritten Weg wurde durch Oxidation und Öffnung des Piperazinrings Verbindung VIII (m/z = 418, Spur) gebildet, die sich nach nachfolgenden Oxidationsschritten schließlich in Verbindung IV (m/z = 294, Rt = 8,7 min) umwandelte. Im nächsten Weg wurde Verbindung VIII (m/z = 418, Spur) gebildet, und durch vollständige Abspaltung der Piperazingruppe wurde Verbindung I in Verbindung IX (m/z = 307, Spur) umgewandelt, die in Verbindung IV umgewandelt wurde ( m/z = 294, Rt = 8,7 min) nach Demethylierung und Spaltung des Cyclopropanrings (Weg IV). Im endgültigen vorgeschlagenen Mechanismus wurde das Fluoratom von Moxifloxacin durch OH (Verbindung X, m/z = 400, Spur) ersetzt und anschließend durch Verlust der Piperazingruppe und Demethylierung in Verbindung III (m/z + 1 = 262, Rt = 6 min) (Weg V).

Mechanismus des Moxifloxacin-Abbaus. Vorgeschlagene Moxifloxacin-Biotransformationswege durch Laccase@Co3(PO4)2·HNFs.

Die Verringerung der Toxizität von Schadstoffen ist durch Abbauverfahren nicht immer gewährleistet; Es gibt sogar Berichte über eine Zunahme der Toxizität von Schadstoffen nach dem Abbau98,99. Um die Effizienz der synthetisierten HNFs zu untersuchen, wurde die Toxizität von Moxifloxacin und seinen Metaboliten gegenüber vier Bakterienstämmen bewertet. Wie in Tabelle S3 gezeigt, wurde die Toxizität der Abbauprodukte nach der Behandlung mit Laccase@Co3(PO4)2·HNFs wirksam verringert. Die Behandlung von Moxifloxacin mit den konstruierten HNFs reduzierte den GI-Prozentsatz für P. aeruginosa um 67 %. Die GI-Reduktion (%) für S. aureus, S. epidermidis und E. coli betrug 24,6 %, 48,7 % bzw. 12 %. Einige der FQ-Abbauprodukte zeigten antimikrobielle Aktivität. Aufgrund der Verstärkung der DNA-Gyrase-Aktivität durch Fluor führte die Defluorierung von Moxifloxacin zu einer deutlichen Verringerung seiner biologischen Aktivität. Außerdem weisen die meisten der identifizierten Abbauprodukte eine geringere Hydrophobie auf, was ihre Diffusion durch die Zellmembran einschränken kann97,100,101.

Diese Studie berichtete über einen einfachen Ansatz für die sofortige Synthese von HNFs, der als „konzentrierte Methode“ bezeichnet wird. Im Gegensatz zu zuvor berichteten Syntheseverfahren wurden bei der Synthese von HNFs hohe Konzentrationen an Phosphat- und Kobaltionen eingebaut. Die Bildung primärer Keimbildungsstellen (proteinanorganische Nanokristalle) und deren anisotropes Wachstum waren die Hauptschritte bei der Synthese von HNFs nach dieser Methode. Eine schnelle Herstellung von HNFs wurde durch die Erhöhung der Anzahl primärer Nanokristalle erreicht, was deren Kollisionsrate verbesserte und das Wachstum von HNFs beschleunigte. Daher erforderte die Synthese von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs keine verlängerten Inkubationszeiten (12–72 Stunden) und keine rauen Bedingungen wie Ultraschall und Vortexen. Die katalytische Effizienz, die kinetischen Parameter und die Stabilität der Laccase wurden nach der Enzymimmobilisierung in HNFs verbessert. Allerdings war die Immobilisierungsausbeute im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten Arbeiten nicht sehr hoch (65,3 %), was möglicherweise die Kosteneffizienz der Immobilisierungsmethode verringert. Basierend auf CD- und Fluorimetrie-Spektren ist ein höherer α-Helix-Gehalt von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs als das freie Enzym für die erhöhte Stabilität der konstruierten HNFs verantwortlich. Die Fähigkeit der immobilisierten Laccase, Moxifloxacin zu entfernen, wurde erstmals in dieser Studie gezeigt. Das Antibiotikum wurde sowohl durch Adsorptions- als auch durch biologische Abbaumechanismen entfernt und die Toxizität der Abbauprodukte gegenüber zwei G+- und zwei G−-Bakterien war geringer als beim Ausgangsfluorchinolon. Allerdings wurde die Toxizität der Abbauprodukte gegenüber S. aureus (18,5 %) und E. coli (8,8 %) geringfügig verringert. Die beschriebene Methode zur Synthese von Laccase@Co3(PO4)2·HNFs könnte für die Synthese einer breiten Palette von HNFs unter Verwendung verschiedener organischer und anorganischer Komponenten verwendet werden. Die Erforschung der Bildung von Laccase-basierten HNFs mit verschiedenen Metallen wird Aufschluss über die Wechselwirkung von Laccase mit festen Metallphosphaten geben. Außerdem ist das derzeitige Wissen über den Bildungsmechanismus von HNFs derzeit begrenzt und weitere Studien sind erforderlich, um neue Methoden für die Synthese von HNFs auf Laccase-Basis zu erforschen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Diese Arbeit wurde durch die Fördernummer 1400-2-104-54845 vom Biotechnology Research Center, Tehran University of Medical Sciences, Teheran, Iran, an MAF finanziell unterstützt

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Khashayar Vojdanitalab und Hossein Jafari-Nodoushan.

Abteilung für Pharmazeutische Biotechnologie, Forschungszentrum der Fakultät für Pharmazie und Biotechnologie, Medizinische Universität Teheran, Postfach 14155−6451, Teheran, 1417614411, Iran

Khashayar Vojdanitalab, Hossein Jafari-Nodoushan, Somayeh Mojtabavi, Mahtab Shokri und Mohammad Ali Faramarzi

Forschungszentrum für Pharmazeutische Wissenschaften, Teheraner Zweigstelle für Medizinische Wissenschaften, Islamische Azad-Universität, Teheran, Iran

Khashayar Vojdanitalab, Mahtab Shokri und Hoda Jahandar

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KV: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung und Schreiben – Originalentwurf. HJ: Datenkuratierung, Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, Visualisierung und Software. SM: formale Analyse, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung sowie Konzeptualisierung. MS: Visualisierung, Untersuchung und Methodik. HJ: Software, Validierung und Untersuchung. MAF: Aufsicht, Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Datenkuratierung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Projektverwaltung und Finanzierungsbeschaffung.

Korrespondenz mit Mohammad Ali Faramarzi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Vojdanitalab, K., Jafari-Nodoushan, H., Mojtabavi, S. et al. Sofortige Synthese und vollständige Charakterisierung organisch-anorganischer Laccase-Kobaltphosphat-Hybrid-Nanoblumen. Sci Rep 12, 9297 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13490-w

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Eingegangen: 11. Februar 2022

Angenommen: 25. Mai 2022

Veröffentlicht: 03. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13490-w

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